4-香豆酸：fu酶A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶,，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸fu酶A酯,，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物,、酵母和菌類中,，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù),。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和CoA 生成 4-香豆酸CoA,，在 333nm 下測 4-香豆酸CoA 生成速率,，即可反映 4CL活性,。

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試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1ml 石英比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液提取：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

測定步驟：

1,、分光光度計(jì) 40℃預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 333nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1） 在試劑二中加入 12.5ml 試劑一充分溶解混勻,，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min,；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h

內(nèi)用完）,；

（2） 測定管：在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 試劑二,，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃

反應(yīng) 30min 后的吸光值A2,。

對照管：在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 試劑一,，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃

反應(yīng) 30min 后的吸光值A1,，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對照管,。

4CL 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸fu酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸fu酶A 定義為一個(gè)酶活力單位,。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸fu酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.063×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10-3 L；ε：4-香豆酸fu酶A 摩爾消光系數(shù),，2.1×104 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬,。

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