線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

TH 位于線粒體的內(nèi)膜上,，又稱為線粒體復合體六,，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH 相互轉(zhuǎn)化,，調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡,。把逆向反應稱為 TH-2，催化 NADPH 和NAD⁺生成NADP⁺和NADH,。

測定原理：

NADH 和NADPH 均在 340nm 有特征吸收,，因此TH 催化的轉(zhuǎn)氫反應不能導致 340nm 吸光度發(fā)生變 化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代 NAD⁺,，TH-2 催化APAD⁺還原生成APADH,， APADH 在 375nm 有特征光吸收，測定 375nm 光吸收的增加速率,，來計算 TH-2 活性,。

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒 氧化磷酸化

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

3,、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

4,、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的TH-2（此步可選做）。

5,、步驟 4 中的沉淀即為線粒體,，加入 500uL 試劑二，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲3s，間隔 10 秒,，重復 30 次）,，用于TH-2 活性測定。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 375nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1） 工作液的配制：臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃

（其它物種）水浴 5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 樣本和 180μL 工作液,，混勻,，立即記錄 375nm 處初始吸光值A1 和 10min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

TH-2 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位,。

TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。

TH-2 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位,。

TH-2 活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.149×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，2×10-4 L；ε：APADH 摩爾消光系數(shù),，6.7×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.5mL；T：反應時間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。

TH-2 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位,。

TH-2 活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位,。

TH-2 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.298×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L,；ε：APADH 摩爾消光系數(shù),，6.7×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑,，0.5cm,；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.5mL,；T：反應時間，10 min,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。

線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒 氧化磷酸化