線粒體轉氫酶-1（TH-1）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

TH 位于線粒體的內膜上,，又稱為呼吸電子傳遞鏈復合體六，催化 NADH+NADP⁺和 NAD⁺+NADPH相互轉化,。催化正向反應稱為 TH-1,。線粒體 NADH 含量增加時會導致線粒體膜的H+電化學梯度升高，因而促進了電子傳遞鏈上ROS 的產生,。TH-1 促進NADH 轉換為NADPH,，從而提高線粒體的抗氧化能力。

測定原理：

NADH 和NADPH 均在 340nm 有特征吸收,，因此TH 催化的轉氫反應不能導致 340nm 吸光度發(fā)生變化,。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代NADP⁺，TH-1 催化 APADP⁺還原生成的APADPH 在 375nm 有特征光吸收,，因此通過測定 375nm 光吸收增加速率,，來計算 TH-1 活性。

線粒體轉氫酶-1（TH-1）試劑盒 氧化磷酸化

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,，加入 1mL 試劑一,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2,、將勻漿 600g,，4℃離心 5min。

3,、棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11100g,，4℃離心 10min,。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的TH-1（此步可選做）,。

5,、步驟 4 中的沉淀即為線粒體，加入 500uL 試劑二,，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲3s,，間隔 10 秒,，重復 30 次），用于TH-1 活性測定,。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 375nm,，蒸餾水調零,。

2、樣本測定

（1） 工作液的配制：臨用前將試劑四,、五轉移到試劑三中混合溶解,，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃

（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 樣本和 180μL 工作液,，混勻,，立即記錄 375nm 處初始吸光值A1 和 10min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

TH-1 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位,。TH-1 活性（nmol/min

/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位。TH-1 活性（nmol/min /g鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位,。TH-1 活性

（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.149×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，2×10-4 L；ε：APADPH 摩爾消光系數,，6.7×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積,，0.5mL,；T：反應時間，10 min,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,；500：細菌或細胞總數,，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位,。TH-1 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位,。TH-1 活性（nmol/min /g鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產生 1 nmol APADPH 定義為一個酶活性單位。TH-1 活性

（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.298×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：APADPH 摩爾消光系數，6.7×10³ L / mol /cm,；d：96 孔板光徑,，0.5cm；V 樣：加入樣本體積,，0.02 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.5mL,；T：反應時間,，10 min； Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,；500：細菌或細胞總數,，500 萬。

線粒體轉氫酶-1（TH-1）試劑盒 氧化磷酸化