線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞se素C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞se素C 的氧化,，并最終把電子傳遞給氧，生成水,。

測定原理：

還原型細(xì)胞se素 C 在 550nm 有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞se素 C 生成氧化型細(xì)胞se素C,，因此 550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性,。

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒   氧化磷酸化系列

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10ul 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2、將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11100g,，4℃離心 10min。

4,、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。

5,、步驟 4 中的沉淀即為線粒體,，加入 200ul 試劑二和 2ul 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或200W,，超聲 3s，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次）,，用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測定。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 550nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1） 工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μl 樣本和 200μl 工作液,，混勻,，記錄 550nm 處初始吸光值A1 和 37℃反應(yīng) 30min 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2,。

注意事項:

1,、若ΔA 大于 0.2,，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，使A1-A2 小于 0.2,，可提高檢測靈敏度,。

2、動物肝臟樣本由于酶活性過高， 1 分鐘內(nèi)吸光值就會到達(dá)平臺期,，務(wù)必先進(jìn)行 2 個樣本的預(yù)測定,。可將樣本用試劑二稀釋 10~50 倍,，反應(yīng)時間縮到到 30 秒或 1 分鐘（計算公式中代入實際反應(yīng)時間,，并乘 以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。其他樣本可按照正常測定步驟進(jìn)行。

復(fù)合體Ⅳ活力單位的計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解 1 nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素 C 定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=3.88×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個酶活力單位,。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.008×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.2×10-4 L,；ε：細(xì)胞se素C 摩爾消光系數(shù),，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml；T：反應(yīng)時間,，30 min,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬,。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解 1 nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素 C 定義為一個酶活力單位,。

復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.76×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解 1nmol 還原型細(xì)胞se素C 定義為一個酶活力單位。復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.016×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.2×10-4 L,；ε：細(xì)胞se素C 摩爾消光系數(shù)，1.91×104 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V 樣：加入樣本體積,，0.02 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml；T：反應(yīng)時間,， 30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬,。

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒   氧化磷酸化系列