果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase,，PFK）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，負責將果糖-6-磷酸和ATP 轉(zhuǎn)化為果糖-1,6 二磷酸和ADP,，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理：

PFK 催化果糖-6-磷酸和ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化 NADH 氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 下降速率,，即可反映PFK 活性,。

果糖-6-磷酸激酶試劑盒 糖酵解系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存,，臨用前加入 2.8ml 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融,；

試劑三：粉劑×1 支,，4℃保存，臨用前加入 260μl 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20 度保存,，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：液體 16μl×1 支,，4℃保存,，臨用前加入 260μl 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20 度保存,，禁止反復(fù)凍融,；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟和加樣表：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、工作液（可測 25 個樣）的配制：取 19ml 試劑一和 1.26ml 試劑二充分混勻,；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融,；

3,、將工作液置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。

4,、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中,，立即混勻，加試劑四的同時開始計時,，記錄在 340 nm 波長下20 秒時的初始吸光度A1 和 10 分 20 秒時的吸光度 A2,，計算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中 PFK 活力不一樣,，做正式試驗之前請做 1-2 只預(yù)試,，若ΔA>0.5，則說明活力太高,，必須用提取液稀釋成適當濃度勻漿上清液（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，或縮短反應(yīng)時間至 2min 或5min，使ΔA<0.5,，以提高檢測靈敏度,。

PFK 活力單位的計算：

1,、血清（漿）PFK 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

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PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=450×ΔA 2,、組織,、細菌或細胞中 PFK 活力計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP 定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=450×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.225×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,， 1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.03 ml,；

V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間,，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細菌或細胞總數(shù),，2000 萬。

果糖-6-磷酸激酶試劑盒 糖酵解系列