己糖激酶(hexokinase,，HK)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，是葡萄糖分解過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶,，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖,，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn),。

測(cè)定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADPH,， NADPH 在 340nm 有特征吸收峰,。

己糖激酶試劑盒   糖酵解系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存,；臨用前加入 30ml 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑四：粉劑×1 支,，-20℃保存，臨用前加入 4ml 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存,；臨用前加入 2ml 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存,；臨用前加入 250μl 試劑一和 250μl 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1 ml 石英比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、將試劑一,、二,、三、四和五 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘,。

3,、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混勻,，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí),，在 340 nm 波長下記錄 20秒時(shí)的初始吸光度A1 和 5 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

注意事項(xiàng)：

1,、為了減小操作誤差，建議將試劑一、二,、三,、四、五按比例配成混合液,，預(yù)熱 10min,，取 30μl 樣本+8μl試劑六+1ml 混合液，混勻后按照上述步驟檢測(cè),。

2,、不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做 1-2 只預(yù)試,，若ΔA>0.5,，則說明組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，或縮短反應(yīng)時(shí)間至 2min,使 ΔA<0.5,，以提高檢測(cè)靈敏度,。

HK 活性計(jì)算：

1,、血清（漿）HK 活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1113×ΔA 2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活性

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

HK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1113×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

HK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.226×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.038×10^-3 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.03 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬,。

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