1999年,，一名患有鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥的患者接受一劑攜帶校正基因的腺病毒載體注射,，產(chǎn)生大規(guī)模免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多器官衰竭和腦死亡,。由于1999到2002年遭遇的這一事故和其他臨床挫折,，基因治療領(lǐng)域的投資在隨后的幾年中經(jīng)歷了急劇而持續(xù)的下降。
但與此同時,，為了確保將外源DNA更安全地引入哺乳動物細胞和生物體中,，技術(shù)革新仍在繼續(xù)。例如,，基因遞送系統(tǒng)的改進使得細胞因子,、siRNA和其他基因替代策略的遞送更安全，且在體外,、體內(nèi)臨床前和臨床應(yīng)用中都體現(xiàn)出了有效性,。
分類和基本概念
廣義的基因治療的概念即將外源性基因遞送到靶細胞，以調(diào)節(jié),、改變基因組的表達,。主要有三種不同的方法（圖1）?；蜻f送載體的主要特征和組成在很大程度上取決于使用的基因治療方法（如表一）,。
· 基因增補：該方法通常用于面對遵循常染色體隱性遺傳模式的遺傳性疾病，多用的多核苷酸為質(zhì)粒 (pDNA)，而由質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染通常只能保持1~2個月,；另一種常用的為單鏈mRNA,，它的穩(wěn)定時間更短，僅約1小時,。
· 基因抑制：該方法主要用于沉默突變基因的表達,。這這種情況常見于常染色體顯性遺傳之后的遺傳性疾病模式。抑制序列可以是基于單鏈RNA的結(jié)構(gòu),，如microRNA (miRNA),，或雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，如小干擾RNA (siRNA),。
· 基因編輯：用特定的基因編輯工具糾正突變基因,，如CRISPR/Cas9。如CRISPR/Cas9的基因編輯工具可以用不同的載體進行遞送,，如pDNA,、mRNA或核糖核蛋白 (RNP)復(fù)合物，以作用于不同的細胞區(qū)域,。
圖1 三種不同類型基因治療（廣義）示意圖。a) 基因增補療法,；b) 基因抑制療法,；c) 基因編輯
表1 寡核苷酸基因治療中使用的主要多核苷酸的基本特征和性質(zhì)示意圖
病毒載體和非病毒載體
載體是目的基因到達其目標(biāo)目的地的載體，它在產(chǎn)品的安全性和有效性上起到了至關(guān)重要的作用,。常見的遞送載體可分為病毒載體和非病毒載體,。當(dāng)前一部分的臨床研究已經(jīng)應(yīng)用了非病毒載體，但更多的還是保持了傳統(tǒng)的病毒載體系統(tǒng),。
目前市場上有超過20種基因治療產(chǎn)品,，其中3種為非病毒產(chǎn)品（如表2），其余均采用病毒載體遞送系統(tǒng),。Neovasculogen是第一個非病毒基因治療產(chǎn)品,，由人類干細胞研究所（俄羅斯）開發(fā)。它由編碼血管內(nèi)皮生長因子（VEGF-165）的質(zhì)粒作為載體,。第二個產(chǎn)品是Collategene,，一種編碼AnGes（日本）開發(fā)的人肝細胞生長因子（HGF）基因的質(zhì)粒DNA。
表2 使用非病毒載體遞送的基因治療產(chǎn)品
病毒載體可以高效遞送基因,，有效生成持續(xù)修飾的哺乳動物基因組,。但同時，它們也存在一些限制和缺點,。
1. 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒（包括慢病毒）載體存在插入誘變的風(fēng)險,；
2. 使用病毒載體，免疫原性反應(yīng)和炎癥增強的風(fēng)險增加；
3. 當(dāng)病毒DNA作為外來DNA引入哺乳動物細胞時,，它容易出現(xiàn)表觀遺傳沉默,；
4. 病毒生產(chǎn)所需的成本高，對于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)控制成本并不友好,。
非病毒載體可以一定程度上避免病毒載體的限制,，它具有以下優(yōu)勢：
1. 使用非病毒載體更容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和化學(xué)表征，能夠大規(guī)模提高生產(chǎn)的可重復(fù)性,；
2. 非病毒載體具有更高的載量,，更大的轉(zhuǎn)基因能力；
3. 使用非病毒載體毒性低,，免疫原性反應(yīng)小,，安全性更高。
然而依然有一定的壁壘存在,。與病毒載體系統(tǒng)相比,，非病毒系統(tǒng)的效率仍然相對較低，因為編碼轉(zhuǎn)基因的表達仍然是短暫的,。為了克服非病毒載體固有的挑戰(zhàn),，仍然需要進行技術(shù)的優(yōu)化和革新以確保非病毒系統(tǒng)的穩(wěn)定性和有效性。
非病毒載體在體外細胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用
在體外細胞治療領(lǐng)域,，除了常見的用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體引入CAR基因的方式,，還有轉(zhuǎn)座子、mRNA,、CRISPR/Cas9的方式,。
· 轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座子由一個攜帶CAR的質(zhì)粒和一個攜帶轉(zhuǎn)座子酶的質(zhì)粒組成。它具有裝載量大,、安全性高等優(yōu)勢,。這類新系統(tǒng)已證明能夠?qū)崿F(xiàn)較為安全的基因整合，同時保持高效的遞送效率,，有限的脫靶效應(yīng),，并可以生成基因表達穩(wěn)定可靠的轉(zhuǎn)基因細胞。常見的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有睡美人轉(zhuǎn)座子（Sleeping Beauty,，SB）,，PiggyBac等。
· mRNA: mRNA電穿孔是將CAR基因?qū)?/span>T細胞的方法,，但是可以轉(zhuǎn)染的基因容量更小,，轉(zhuǎn)染效率相對于病毒載體以及轉(zhuǎn)座子而言都要更低。不過這種方法相對而言成本更低,，耗時更短,，安全性相對較好,，沒有插入誘變，并且免疫原性可以忽略不計,。
· CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是當(dāng)前使用最為廣泛的基因編輯技術(shù),，它可以通過敲除TRAC等分子，避免GVHD和免疫排斥使CAR-T變成通用型,；還可以敲除免疫檢查點或抑制性分子來提高T細胞或者其它免疫細胞的功能,。
無論哪種非病毒技術(shù)，都需要將外源基因通過一種高效的方法導(dǎo)入到大量的細胞中,。電穿孔已被證明是非病毒轉(zhuǎn)染中前景,、且已經(jīng)是應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。
電穿孔技術(shù)的應(yīng)用
目前已上市的電穿孔平臺,，存在以下缺點：
· 平臺不開放,，參數(shù)調(diào)整優(yōu)化難
· 體系放大一致性欠佳，工藝開發(fā)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化難
· 亦或是商業(yè)模式不大友好,，使用成本高昂
尋找降本增效的電轉(zhuǎn)方案是行業(yè)一致的訴求,。
在電轉(zhuǎn)技術(shù)方面，賽默飛早有儲備,。10多年前賽默飛已推出了Neon電轉(zhuǎn)系統(tǒng),，N在高校和科研院所廣泛應(yīng)用，在免疫細胞中基因編輯領(lǐng)域積累豐富經(jīng)驗,?；谂c細胞治療領(lǐng)域?qū)I(yè)客戶的多年深度合作，賽默飛于2022年推出Gibco™ CTS™ Xenon™大規(guī)模電轉(zhuǎn)染系統(tǒng),，保持了與Neon一致的脈沖配置和開放的操作平臺，通過簡單的優(yōu)化,，即可實現(xiàn)研發(fā)到生產(chǎn)的體系放大,。此外，滿足大體積,、符合GMP生產(chǎn)需求的Xenon也不會收取任何license fee或milestone費用,，真正做到降本增效。
圖2 Gibco™ CTS™ Xenon™大規(guī)模細胞電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)
Gibco CTS Xenon 電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)特點
· 處理量大且快速：處理量為1–25mL,，25分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)染多達2.5x10?個T細胞,；
· 性能可靠，可保持高細胞活力：高達90%的基因敲除效率和80%的細胞活力,；
· 工藝靈活性高：儀器配備了用戶可編程系統(tǒng),，允許用戶在細胞治療的工藝開發(fā)到商業(yè)化生產(chǎn)的所有階段，根據(jù)各種細胞類型和目標(biāo)遞送物創(chuàng)建并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染方案,；
· 非病毒性物理轉(zhuǎn)染：可用于遞送DNA,、RNA和蛋白質(zhì),；
· 封閉式系統(tǒng)處理工藝：MultiShot(MS)耗材可以無菌焊接至PVC管或C-Flex管。
Gibco CTS Xenon 電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)特應(yīng)用案例
1. Gibco™ CTS™ Xenon™實現(xiàn)高效T細胞基因編輯
使用Cas9/gRNA敲除內(nèi)源性T細胞受體（TCR）并敲入表達第二代CAR構(gòu)建體的雙鏈線性DNA,。使用Invitrogen™ Neon™電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（100 μL）,，或在CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)染儀器上使用Xenon SingleShot電轉(zhuǎn)染腔室（1 mL）或Xenon MultiShot電轉(zhuǎn)染套件（18 mL）轉(zhuǎn)染5×10?個細胞/mL，并設(shè)置未轉(zhuǎn)染組,。轉(zhuǎn)染3天后,，通過流式細胞術(shù)分析評估CAR T細胞上的CD19基因表達。使用細胞計數(shù)儀和Gibco臺盼藍染色評估細胞活性,。
圖3 對三個來源于白細胞單采術(shù)的T細胞供體進行CAR T細胞電轉(zhuǎn)染分析
2. Gibco™ CTS™ Xenon™可實現(xiàn)高效NK細胞基因編輯
使用Cas9/gRNA敲除內(nèi)源性B2M基因,。使用Invitrogen™ Neon™電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（100 μL），或在CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)染儀器上使用Xenon SingleShot電轉(zhuǎn)染腔室（1 mL）5×10?個細胞/mL,。轉(zhuǎn)染3天后,，通過流式細胞術(shù)分析評估NK細胞陽性率（中間列）及B2M基因敲除效率（左邊2列）。使用細胞計數(shù)儀和Gibco臺盼藍染色評估細胞活性（右列）,。
圖4 三個來源于白細胞單采術(shù)的NK細胞使用CTS NK-Xpander培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后,，計數(shù)并進行NK細胞電轉(zhuǎn)染分析
3. Gibco™ CTS™ Xenon™可助力大規(guī)模HSC (CD34+ T)細胞的基因改造
在電穿孔后的細胞培養(yǎng)過程中，不同系統(tǒng)間細胞活力相當(dāng) (A),， 基因編輯效率也都維持比較高的水平,，CTS Xenon 1ml SS平均編輯效率為82%±9，Multi-shot平均為75%±8 / 5ml,，Neon 100 μL平均基因編輯效率為81%±7(B),。
圖5 分別使用Neon 100 μL系統(tǒng)和Xenon 1ml SS及5-25ml MS系統(tǒng)電轉(zhuǎn)HSCs細胞，評價Neon到Xenon的可擴展性
Xenon系統(tǒng)可提供多款電轉(zhuǎn)染緩沖液,。CTS Xenon 電轉(zhuǎn)緩沖液（EP buffer）,、基因組編輯緩沖液（GE buffer）和低電導(dǎo)率電轉(zhuǎn)緩沖液（LC buffer)，專為與CTS Xenon 系統(tǒng)配合使用而設(shè)計,，可提供100 mL 瓶裝和袋裝形式,，便于工藝開發(fā)和封閉式系統(tǒng)生產(chǎn)規(guī)模擴大。
Gibco CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)
為了滿足細胞治療生產(chǎn)工藝往自動化封閉式的生產(chǎn)需求,，我們開發(fā)出成熟工藝,，利用CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)靈活、溫和,、輸出體積可低至5ml的特點,，實現(xiàn)電轉(zhuǎn)前細胞電轉(zhuǎn)液的小體積、高密度,、封閉式置換,，輸出密度可高達5E8細胞/ml，回收率>80%,，活率> 90%,。
圖6 Rotea與Xenon物理連接：利用Rotea將待電轉(zhuǎn)細胞進行洗滌并置換成電轉(zhuǎn)液,，然后通過管路無菌熱接接至Xenon multishot管路中，將需電轉(zhuǎn)的細胞以及payload泵至Xenon電轉(zhuǎn)儀,，實現(xiàn)全封閉的電轉(zhuǎn)流程,。
Rotea可做到高精準(zhǔn)度、低體積輸出并維持高細胞活率和高回收率的儀器,，我們也經(jīng)過內(nèi)部和客戶多方測試,，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CTS Rotea逆流離心系統(tǒng)洗滌濃縮置換電轉(zhuǎn)液的樣品，后續(xù)基因編輯效率與細胞活率都與手工離心置換電轉(zhuǎn)液組相當(dāng),。
圖7 單采血分離PBMC后,，使用dynabeads 一步法分離與激活T細胞。2天后,，分別用Rotea和手工離心對激活的T細胞進行洗滌和電轉(zhuǎn)液置換,，隨即進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)分別采用Neon小電轉(zhuǎn)和CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)進行測試,。圖中上部分為基因編輯效率,，在電轉(zhuǎn)3天后，3個不同的donor中,，Rotea組和手工離心組的基因編輯效率都是相當(dāng)?shù)模?/span>Xenon在21%-36%,，Neon為10%-15%。圖下半部分展示了對應(yīng)各組細胞活率,，均維持在90%左右,。
總結(jié)
基于在非病毒細胞改造技術(shù)方面的多年經(jīng)驗積累，在結(jié)合如CTS Dynabeads,、OpTmizer™ Pro,，NK-Xpander培養(yǎng)基等高品質(zhì)的原材料和Attune流式在線分析和qPCR等質(zhì)控分析方案基礎(chǔ)上，賽默飛全新推出如CTS Xenon大規(guī)模電轉(zhuǎn)儀,、CTS Rotea逆流離心細胞處理系統(tǒng)以及DynaCellect新一代自動化磁珠分選平臺,，通過各儀器的物理連接及Cellmation數(shù)字化整合軟件，賽默飛打造了封閉式,、模塊化和自動化非病毒細胞治療生產(chǎn)解決方案。這一套可擴展性生產(chǎn)解決方案,，可幫助大家實現(xiàn)不同類型細胞療法的降本增效及國際化工藝生產(chǎn)的需求,。
圖8 賽默飛非病毒細胞治療生產(chǎn)解決方案概覽
此外，賽默飛基于CTS Rotea和CTS Xenon構(gòu)建了封閉式整合平臺,，并實現(xiàn)了CAR T細胞的高效生產(chǎn),。基于CTS 儀器的模塊化特性,，加上其數(shù)字化和物理整合能力,，可靈活配置滿足多樣化生產(chǎn)需求,。掃描下方二維碼獲取“采用封閉式集成式儀器工作流程，高效生產(chǎn) CAR T 細胞"原文,。
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