為什么研究線粒體
線粒體在健康和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不僅是能量產(chǎn)生的關(guān)鍵,，還有很多其他功能 [1]：
離子穩(wěn)態(tài)：從鐵和鈣的穩(wěn)態(tài)到激素和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生,，都離不開線粒體。特別是在鈣穩(wěn)態(tài)中,，線粒體作為調(diào)節(jié)者,、緩沖池和傳感器參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)。線粒體可以儲存和釋放鈣,，從而影響細(xì)胞質(zhì)中鈣峰值的形狀,、頻率和幅度,，這對于各種細(xì)胞過程都緊密相關(guān)。
胞內(nèi),、胞外交流：線粒體與其他細(xì)胞器和環(huán)境相互作用,，影響各個(gè)生理層面的交流。線粒體是細(xì)胞間通訊的核心,，在復(fù)雜的調(diào)節(jié)活動和細(xì)胞間通訊中充當(dāng)信號細(xì)胞器,。線粒體與細(xì)胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中扮演關(guān)鍵角色,。
免疫系統(tǒng)：線粒體可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能及其對感染的反應(yīng),。線粒體負(fù)責(zé)產(chǎn)生免疫細(xì)胞激活、增殖和行使功能所需的能量,。線粒體還參與活性氧的產(chǎn)生,，這對于免疫細(xì)胞的抗菌能力相當(dāng)重要。此外,，線粒體還參與免疫細(xì)胞死亡和炎癥的調(diào)節(jié),。位于線粒體外膜上的線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）在病毒感染的免疫反應(yīng)中至關(guān)重要。因此,，線粒體健康與免疫系統(tǒng)功能息息相關(guān)。
腸道微生物群：腸道微生物群可以影響線粒體新生,，從而影響能量產(chǎn)生和其他線粒體功能,。線粒體可以通過產(chǎn)生活性氧和其他代謝物來影響腸道微生物群的組成。線粒體和腸道微生物群之間的這種相互作用對于維持腸道健康來說是非常重要的,，并且與多種疾病有關(guān),，包括代謝綜合征、炎癥性腸病和神經(jīng)退行性疾病,。
生物鐘：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,，線粒體活動和動態(tài)會影響晝夜節(jié)律，并且線粒體與晝夜系統(tǒng)相互作用以調(diào)節(jié) NAD+ 等關(guān)鍵分子的生物合成,。
線粒體功能障礙與疾病的關(guān)系
線粒體功能障礙與多種疾病相關(guān),，包括代謝綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)疾病,、癌癥,、心血管疾病、傳染病以及炎癥性疾病,，下面是幾個(gè)例子：
代謝綜合征：線粒體功能障礙可能導(dǎo)致代謝綜合征,，這種疾病的特征包括高血壓、高血糖和水平異常等一系列癥狀,，這些疾病會增加患心臟病,、中風(fēng)和二型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn),。
神經(jīng)系統(tǒng)疾病：線粒體功能障礙與阿爾茨海默病,、帕金森氏癥和肌側(cè)索硬化 (ALS) 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),。線粒體功能障礙可能導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少和活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,。
癌癥：線粒體代謝的改變可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展,。線粒體功能障礙會導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致 DNA 損傷和突變,，促進(jìn)癌癥的發(fā)展,。
心血管疾病：線粒體功能障礙可能會損害心肌產(chǎn)生能量的能力,，從而導(dǎo)致心臟疾病,，包括心力衰竭、心律失常和其他心血管疾病,。
炎癥性疾?。?/strong>線粒體功能障礙可引發(fā)慢性炎癥，導(dǎo)致各種炎癥性疾病的發(fā)展,，包括自身免疫性疾病,。
線粒體研究的工具
線粒體形態(tài)&定位研究
根據(jù)樣品類型和具體應(yīng)用，線粒體結(jié)構(gòu)標(biāo)記匯總?cè)缦拢?/p> 
MitoTracker 標(biāo)記探針
MitoTracker 探針是小分子 (<1 kDa),、細(xì)胞滲透性線粒體選擇性染料,，含有硫醇反應(yīng)性氯甲基，部分探針可在固定后保持染料與線粒體結(jié)合,。由于探針與線粒體硫醇形成共價(jià)鍵,，因此它們只能用作終點(diǎn)測定，以檢測活細(xì)胞的線粒體膜電位,，不能隨時(shí)間動態(tài)檢測線粒體膜變化,。
圖1. 在A549細(xì)胞中使用 MitoTracker™ Red CMXRos (貨號 M7512) 染色線粒體
CellLight熒光融合蛋白
當(dāng)需要在活細(xì)胞中不依賴于膜電位標(biāo)記線粒體并跟蹤細(xì)胞的行為動態(tài)時(shí)，推薦使用 CellLight 試劑,，操作簡單,、可與其他試劑共用，也可以固定,。
圖2. 在HeLa細(xì)胞中使用CellLight™ Mitochondria-GFP (貨號C10600) 標(biāo)記線粒體
線粒體蛋白抗體
線粒體標(biāo)記抗體特異性檢測線粒體蛋白,，可以幫助研究線粒體的形態(tài)和動力學(xué)以及其他相關(guān)的生理病理狀態(tài)。常見的線粒體靶點(diǎn)有氧化酶（COX）,，氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶線粒體F1復(fù)合體,，熱休克蛋白60，抗增殖蛋白Prohibitin等,。
圖3. 在印度麂鹿皮成纖維細(xì)胞中用小鼠抗 OxPhos Complex V 抑制劑蛋白抗體標(biāo)記線粒體,，搭配二抗 Alexa Fluor™ 555 山羊抗小鼠 IgG (貨號 A21422)
線粒體功能分析
線粒體的損傷包括線粒體氧化還原電位和膜電位的變化,，后者是線粒體健康的一個(gè)核心特征。
線粒體內(nèi)膜電位對Ca2+的吸收和儲存,、活性氧的產(chǎn)生和解毒作用至關(guān)重要,，其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP [2]。
因此,，膜的去極化是評價(jià)線粒體功能障礙的良好指標(biāo),，這與藥物毒性的相關(guān)性越來越高 [3-7]。
膜電位的變化,，以及ATP與ADP比率的降低,、線粒體基質(zhì)鈣水平的增加、氧化應(yīng)激和胞質(zhì)的釋放均被認(rèn)為與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換有關(guān),，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔 (MPTP) 可以改變離子和小分子的穩(wěn)態(tài),。
線粒體功能的破壞可以使用各種熒光試劑盒來檢測，包括線粒體鈣,、超氧化物,、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換和膜電位的檢測。
線粒體膜電位動態(tài)變化的檢測
線粒體膜電位的終點(diǎn)檢測
線粒體超氧化物生成的檢測
細(xì)胞超氧化物生成的增加與多種疾病狀態(tài)有關(guān) [8],。它是氧化磷酸化的副產(chǎn)物,，因此提供了另一種評估線粒體健康和細(xì)胞狀態(tài)的方法。
圖4. 在U2OS細(xì)胞中用MitoSOX™ Green (貨號M36005) 檢測線粒體超氧化物
線粒體鈣離子檢測
線粒體Ca2+ 濃度升高在啟動程序性細(xì)胞死亡（凋亡）以及其他細(xì)胞水平的過程中起著重要作用 [9],。熒光探針在結(jié)合Ca2+ 時(shí)表現(xiàn)出光譜響應(yīng),，使研究人員能夠使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞分析和熒光光譜法研究細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+ 濃度的變化,。
圖5. 線粒體鈣水平和動力學(xué)的多參數(shù)成像。（A）用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2 AM在37℃下標(biāo)記HeLa細(xì)胞15分鐘,，成像時(shí)間超過100秒,。（B–D）為區(qū)域（A）放大的圖像，展示隨著時(shí)間的推移,，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)線粒體,。（C，D）當(dāng)用10μM組織胺處理后,，鈣從內(nèi)部被釋放出來,。Rhod-2橙紅色熒光的增加揭示了線粒體緊鄰鈣釋放的位置。（C）中的箭頭表示線粒體可能損害了鈣吸收,，如果單獨(dú)使用Rhod-2 AM檢測,，可能會遺漏這一細(xì)節(jié)。星號表示單個(gè)線粒體,，顯示鈣水平暫時(shí)升高,。
線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔變化的檢測
線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔 (MPTP) 是位于線粒體內(nèi)外膜的非特異性通道,，研究表示，參與細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放,。MPTP的開關(guān)極大地改變了線粒體的滲透性以及線粒體膜電位,。這種持續(xù)孔隙激活是由線粒體Ca2+ 超載、線粒體氧化,、線粒體活性氧水平升高和其他促凋亡條件引起的,。
參考文獻(xiàn)
1) Casanova, A., Wevers, A., Navarro-Ledesma, S., & Pruimboom, L. (2023). Mitochondria: It is all about energy. Frontiers in Physiology, 14.
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8) He L, He T, Farrar S et al.(2017) Antioxidants Maintain Cellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species. Cell Physiol Biochem 44: 532-553.
9) Giorgi C, Romagnoli A, Pinton P et al.(2008) Ca2+ Signaling, Mitochondria and Cell Death. Curr Mol Med 8: 119-130.
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