上一期中我們介紹了Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀極其出色的硬件性能,，以及在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的非凡表現(xiàn),。本期帶大家領(lǐng)略其如何將生物制品質(zhì)譜表征工作變得更簡單、看到生物制品最真實的原貌,！

當(dāng)前常規(guī)生物制品質(zhì)譜表征主要包含完整分子量的測定、肽圖解析,、糖型鑒定等,，通常利用不同的樣品前處理獲得復(fù)雜生物制品的完整分子量、氨基酸序列結(jié)果,，然而在一定程度上卻失去了樣品的完整信息,，引入其他副反應(yīng)。大家知曉可以用Top-Down,、Middle-Down的分析流程解決這一問題,，但由于質(zhì)譜儀性能的局限，未得到廣泛的應(yīng)用,。

賽默飛作為科研領(lǐng)域的先者,，致力于解決分析難題，型Orbitrap Eclipse™將“簡單又復(fù)雜"的生物制品質(zhì)譜表征帶入了“Top/Middle-Down時代",。

 

 

1復(fù)雜生物制品的完整分子量測定——糖基化位點較多的融合蛋白類

得益于PTCR（質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少）技術(shù),、深度真空技術(shù)（氣壓可調(diào)0.5-20mTorr）。

單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質(zhì)性相對較低,，在傳統(tǒng)的LC-MS/MS（變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件）中能夠獲得高信噪比,、高質(zhì)量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點較多的融合蛋白類,，如細胞因子融合蛋白,，異質(zhì)性非常高，即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區(qū)分每一成分（圖1A）,，通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型,，降低譜圖復(fù)雜性，然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息,。

圖1. 細胞因子融合蛋白分子量測定; 1A. 去唾液酸后在native條件質(zhì)譜圖 1B.經(jīng)過PTCR反應(yīng)后質(zhì)譜圖 1C.經(jīng)BioPharma軟件去卷積后的各成分質(zhì)量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)

Orbitrap Eclipse™ 針對不同的樣品分析可調(diào)節(jié)IRM中氣壓,，提高信號響應(yīng),，以及PTCR強力的加持技術(shù)則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題，如圖1所示,，在圖1A中選擇帶多質(zhì)子且信號強度較高的m/z5677-5757范圍,，經(jīng)PTCR反應(yīng)后降低質(zhì)子數(shù)，從而降低各電荷態(tài)間的重疊度（圖1B）,，此時可清晰的分辨每一成分,，BioPharma Finder軟件去卷積后獲得該融合蛋白主要成分的分子量（圖1C），為復(fù)雜生物制品的表征提供完整信息,。

2非變性蛋白Top-Down分析

得益于ETD,、EThcD、UVPD,、HCD,、深度真空技術(shù)、HMR?,、PTCR技術(shù)

（型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀集各種利器于一身）

對于做蛋白藥物質(zhì)譜表征分析的人來說,，理想的狀態(tài)是使用快速簡單甚至無需樣品前處理，直接進入LC-MS/MS或MS only對蛋白藥物進行表征,，高效且降低樣品前處理引入的干擾,，同時可直接對電荷變異體成分進行快速的確證。而現(xiàn)實是由于抗體分子大,，碎片離子少且復(fù)雜導(dǎo)致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度,，實用價值低。Orbitrap Eclipse™將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度,。

以Herceptin®抗體為例,，溶液置換成50mM乙酸銨（Herceptin®濃度為2ug/uL），不經(jīng)LC通過注射泵直接進入MS中,，獲得高信噪比高質(zhì)量精度的一級譜圖（圖2）,，隔離豐度的母離子（+27價）分別進行HCD、ETD,、EThcD及UVPD的碎裂,，且使用Orbitrap 240,000分辨率進行高準(zhǔn)確度二級碎片離子掃描，由于Orbitrap Eclipse™具有HMR?選項,，可在二級譜圖中看到m/z達8000的豐富碎片離子,。

圖2.非變性Herceptin®高質(zhì)量精度的一級質(zhì)譜圖，不同碎裂模式下的二級質(zhì)譜圖

 

圖3. 經(jīng)BioPharma Finder解析后輕重鏈氨基酸序列覆蓋度

經(jīng)BioPharma Finder解析后,，輕鏈氨基酸序列覆蓋度為57%,，重鏈氨基酸序列覆蓋度為36%（圖3），碎片離子質(zhì)量偏差在3ppm以內(nèi)，Orbitrap Eclipse™在非變性條件下Top-Down結(jié)果刷新了以往的記錄?1?,。

 

值得注意的是,，PTCR技術(shù)不僅在復(fù)雜生物制品分子量測定中大顯身手，而且能夠顯著降低ETD MS2譜圖的復(fù)雜度（圖4）,，大大提高質(zhì)量碎片離子的解析度（圖5）,，從而提升Middle-Down氨基酸序列的覆蓋度（圖6）。

圖4.NIST mAb Fd亞基經(jīng)ETD碎裂以及PTCR反應(yīng)后的二級碎片離子質(zhì)譜圖

 

圖5.ETD only與ETD with PTCR二級/三級碎片離子鑒定分布圖

 

圖6.NIST標(biāo)準(zhǔn)抗體Middle-Down氨基酸序列覆蓋度

3基于以上的優(yōu)勢性能,，可進一步擴展其應(yīng)用領(lǐng)域

如電荷變異體的快速鑒定,；利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide復(fù)合物篩選高免疫原性疫苗時，采用Orbitrap Eclipse™測定復(fù)合物的完整分子量和Top-Down,，來評估多肽的交換（圖7）,；此外多種碎裂方式與超高分辨率Orbitrap的組合能夠更加準(zhǔn)確的對未知蛋白進行從頭測序（De-novo sequencing）。

圖7.Orbitrap Eclipse™評估MHC與多肽的交換,，助力高免疫原性疫苗的篩選（Data Courtesy :Genentech）

 

結(jié)語：目前Orbitrap Eclipse™是功能齊全的高分辨質(zhì)譜儀之一,，旨在解決蛋白質(zhì)分析中挑戰(zhàn)的問題，持此利器定能推動生物學(xué)研究的進一步發(fā)展,。

至此,，ASMS新品連載正式完結(jié)啦！快和賽默飛一起回顧下賽默飛2019新品質(zhì)譜的精彩瞬間~

賽默飛于ASMS 2019上發(fā)布的兩款新品質(zhì)譜再次刷新了Orbitrap的記錄——

全新一代Q Orbitrap旗艦機 Orbitrap Exploris™480 質(zhì)譜儀,，體積小巧但性能，穩(wěn)定耐久,。天才不“繁",，勢必將蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究推向新的高度,。

堪稱創(chuàng)新之作的型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀,，集各種高能軟硬件技術(shù)于一身，性能比尖,，輕松應(yīng)對蛋白質(zhì)組學(xué),，生物制藥與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析研究中的各項挑戰(zhàn)。

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