Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit 

目錄號：K2574 

保存：2-8℃避光保存 

組分說明

                                              Cat.No.              K2574

                                               KitSize                50

                                         4×BindingBuffer             10ml

                                       PropidiumIodide,，PI           500 μl 

                                          AnnexinV-FITC             250 μl

產(chǎn)品簡介 

    AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒是一種采用AnnexinV-FITC 與 PI 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面,，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面,。PS是一種帶負電荷的磷脂,，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面,，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV具有易于結合到磷脂類如PS的特性,，對PS有高度的親和性,。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS,。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所*的,，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞,。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通過完整的活細胞，但能夠對壞死和凋亡晚期的細胞進行染色,，因此通常將AnnexinV 與PI 配合染色,，以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。

注意事項 

1.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測,。

2.  需自備PBS 和去離子水,。

3.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光,，以減緩熒光淬滅,。

4.  PI 對人體有刺激性，請注意適當防護,。

5.  請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

操作步驟 

1. 細胞樣品的準備：

    a. 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細胞,，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打

下來時,，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞,，并輕輕吹散細胞,。再次收集到離心管內(nèi),。1000×g 左右離心3-5 分鐘,，沉淀細胞。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,，可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液,，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的    PBS，重懸細胞,，再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清。再次加入1ml4℃預冷的PBS,，重懸細胞,，再次離心沉淀細胞。

    b. 對于懸浮細胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細胞,。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,，可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞,。加入約1 ml 4℃預冷的PBS,，重懸細胞,，并轉移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清,，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細胞,。再次加入1ml4℃預冷的PBS，重懸細胞,，再次離心沉淀細胞,。

2.  用去離子水按 1:4 稀釋BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去離子水）；

3.  用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞,，調節(jié)其濃度為 1×106/ml,；

4.  取 100μl 的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μlAnnexinV/FITC和10μl20μg/ml的PI 溶液,；

5.  混勻后于室溫避光孵育15分鐘,；

6.  在反應管中加400μlPBS，流式細胞儀（FACS）分析。

    

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