EF03B-J2b                     2016-01版

喹諾酮類

快速檢測試劑盒說明書

一,、原理

   試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物喹諾酮類藥物的含量。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：      0.1ppb

• 孵育溫度：          25℃

• 孵育時間：          30min～15min

• 樣本檢測下限

組織 ,、血清 ——————————1ppb

• 交叉反應(yīng)率

恩諾沙星（ENR）   ————————100%

環(huán)丙沙星（CIF）   ·————————  100%

氧氟沙星（OFL）    ·————————  60%

奧索利酸（OXO）  ·————————  116.86%

達(dá)氟沙星（DAN）  ——————————  102.63%

諾氟沙星（NOR）  ——————————  148.65%

洛美沙星（LOM）  ——————————   86.24%

培氟沙星（PEF）   ·——————————  156.60%

依諾沙星（ENO）  ——————————   98.97%

氟喹酸（FLU）    ——————————   96.73%

麻保沙星（MAR）  ·——————————110.63%

氨氟沙星（AMI）  ————————————  98.86%

那氟沙星（NAD）  ————————————   56.81%

• 樣本回收率

組織、血清 ·———————————— 85±20%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀,、打印機、均質(zhì)器 ,、振蕩器,、離心機,、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul,、單道100～1000ul,、多道 250 ul

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

處理任何樣本時,，都必須注意：

（a） 實驗中必須使用一次性吸頭,，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔,，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

• 樣本前處理需配制：

配液1 樣本復(fù)溶液

將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）進(jìn)行稀釋,。

• 樣本處理：

a）組織樣本處理方法

1,、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2,、加入10ml樣本復(fù)溶液,，振蕩3min，4000r/min以上,，15℃離心10min,；

3、取上清50µl液體用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：10

b）血清樣本處理方法

• 取50µl澄清的血清,，加入450µl 樣本復(fù)溶液混合，混勻30S（如果血清樣本渾濁,，將樣本于10℃,，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清,，直至得到澄清的樣本）,；

• 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍  

六,、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）,。

• 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

• 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。

• 按需要取出微孔條及板架,，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃,，不要冷凍,。

• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。

• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置,。

• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔,，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔,，再加入抗體工作液50µl/孔,。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板,，25℃環(huán)境反應(yīng)30min,。

• 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒,，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。

• 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境避光顯色15min,。

• 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845,； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635,；2.7ppb為0.326,； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb,。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%,，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。

八,、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。

• 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。

• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下。

• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,，表示試劑可能變質(zhì)。

• 該試劑盒zui理想反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍,。

• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒,。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果,，請放心使用,。

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