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【SPEX 組織研磨儀】DNA提取方法的有效性和回收率比較：手動均質(zhì)化與Spex Genomax
檢測樣品：肉組織 肌肉 肉 肉類 DNA 基因 核酸
檢測項目：DNA 基因 核酸
方案概述：這項研究將證明使用自動化均質(zhì)化方法在節(jié)省時間方面的效率,，以及對遺傳物質(zhì)的回收和提取的改進,。在之前使用SpexGeno/Grinder的研究中，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和環(huán)境產(chǎn)品的農(nóng)藥提取大大增強了回收率，同時顯著縮短了樣品制備的處理時間,。
有效地均質(zhì)化生物組織和破壞細胞的能力對于產(chǎn)生足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA和RNA研究所需的核酸至關(guān)重要,。此外,，由于其整體異質(zhì)性或?qū)嶒炇医邮盏降臓顟B(tài),，許多樣品需要均質(zhì)化或減小顆粒大小以創(chuàng)建代表性樣品。均勻性是指在整個樣品中具有一致組成狀態(tài),，而異質(zhì)性則在一個或多個特征上缺乏一致性,。
實驗室或分析樣品必須經(jīng)過處理，以便進行提取,、加工或消化以進行進一步測試,。在生物樣品中，均質(zhì)化可以通過破壞生物組織和溶解細胞來加速處理速度,，從而允許提取遺傳物質(zhì),。獲得均勻樣品的常見方法是研磨或粉碎，這可以提高準確性并減少不確定性,。在實驗室中,，一些科學家使用手動或半自動的方法進行組織處理，這可能會耗費時間并且產(chǎn)生的樣品可能沒有完荃均質(zhì)化,。實施自動化的均質(zhì)化和處理可以提高樣品的處理量,，同時從生物材料中更快地恢復(fù)DNA/RNA。
這項研究將證明使用自動化均質(zhì)化方法在節(jié)省時間方面的效率,，以及對遺傳物質(zhì)的回收和提取的改進,。在之前使用Spex Geno/Grinder®的研究中，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和環(huán)境產(chǎn)品的農(nóng)藥提取大大增強了回收率,，同時顯著縮短了樣品制備的處理時間,。
在這項新的研究中（由Spex和HoppeSyler共同進行的聯(lián)合項目），使用手動小球攪拌器和自動化均質(zhì)器（Spex Genomax）來破壞各種生物組織,，然后在進行基因組DNA（gDNA）分離之前。分離的gDNA隨后用于下游敏感的應(yīng)用中,，以確定手動與自動均質(zhì)器在分析學和分子生物學研究中的有效性,。
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方法和材料
該工作流程主要涉及三個過程：1. 組織均質(zhì)化；2. DNA提??；3. DNA分離。
組織均質(zhì)化
將60毫克的新鮮組織加入500微升的DNA結(jié)合緩沖液和20微升的蛋白酶K（20 mg/mL）,，這些試劑來自Spex DNAmax動物基因組DNA分離試劑盒,。根據(jù)制造商的協(xié)議進行組織的均質(zhì)化和處理。然后將樣品在55ºC下以700 rpm的速度輕輕搖動15分鐘進行孵育,。在蛋白酶K消化后,，向裂解物中加入20微升的RNase A,，并在室溫下孵育五分鐘，然后加入200微升的>95%乙醇,。然后通過渦旋器將裂解物劇烈混合五秒鐘,。
DNA提取和柱清洗
渦旋后，將700µL裂解物加載到DNAmax試劑盒提供的硅膠旋轉(zhuǎn)柱上,，并在室溫下以13,000 xg離心一分鐘,。丟棄流過液，并將500µL來自試劑盒的洗滌緩沖液A（添加了乙醇）添加到柱中,，再次離心三分鐘,。丟棄所得的流過液。
DNA分離和洗脫
將柱子離心額外一分鐘,，并丟棄收集管,。向柱子中加入100 µL的EB或TE緩沖液（pH 8.0），并在室溫下靜置三分鐘,，然后再次離心一分鐘,。收集含有純化的gDNA的流過液進行分析和qPCR。
手動 VS Genomax：核酸分離和回收
在比較手動和自動研磨的第一次研究中,，各種動物組織（牛里脊肉,、雞胸肉和小鼠心臟）的樣品經(jīng)過均質(zhì)化、提取和分離gDNA的處理,。使用手動均質(zhì)化的樣品平均處理時間超過200分鐘（接近2個半小時）,，而使用Spex Genomax的時間不到1/2小時（圖1）。使用自動化的Genomax方法,，處理時間減少了超過86%,。
圖1. 使用手動和Genomax處理gDNA均質(zhì)化、提取和分離的處理時間
比較了三種動物組織（牛里脊肉,、雞胸肉和小鼠心臟）中提取的遺傳物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量,。牛里脊肉和雞胸肉代表了不同密度的動物肌肉組織。小鼠心臟代表了難以均質(zhì)化的纖維狀動物器官組織,。傳統(tǒng)上,，高密度和纖維狀組織難均質(zhì)化，并且產(chǎn)生的可回收gDNA量少,。使用手動方法和Genomax處理后,，分離gDNA并使用紫外/可見光譜法測試濃度（圖2）。
圖2. 使用手動和Genomax方法在不同動物組織中回收DNA
手動方法通常會導致DNA提取和分離不完整,，而使用Genomax進行自動化均質(zhì)化手動方法通常會導致DNA提取和分離不完整,，而使用Genomax進行自動化均質(zhì)化可以實現(xiàn)完荃的均質(zhì)化和高效的提取，如圖3中的電泳凝膠所示。
圖3. 使用手動和Genomax自動化均質(zhì)化處理的DNA的凝膠電泳
在這項首冫欠研究的一項后續(xù)研究中,，使用商用手動小球混合器和Spex Genomax均質(zhì)器對30毫克的小鼠心臟進行均質(zhì)化,。根據(jù)制造商的建議，使用手動均質(zhì)器對小鼠心臟進行均質(zhì)化,，而Genomax中的組織則經(jīng)過三輪均質(zhì)化處理,，每輪以1500 rpm的速度均質(zhì)化1分鐘，每輪之間有20秒的暫停,。使用Spex DNAmax試劑盒分離DNA,，并使用涵蓋小鼠Ostβ啟動子或Hic1基因體的引物制備用于qPCR分析的樣品。每個分析都進行了雙重檢測,。與手動均質(zhì)化相比,，發(fā)現(xiàn)Genomax的產(chǎn)量增加了35倍。實際上,，在使用0.25 µL至1 µL的分離gDNA時,，Genomax樣品產(chǎn)生了強烈的曲線，而使用手動均質(zhì)器分離的gDNA生成了1 µL的擴增曲線（圖4）,。
圖4. 小鼠有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運β啟動子的復(fù)制,。9號染色體，65330248-65330323(75個堿基對) ,，使用Genomax和手動處理
使用較小體積的gDNA（0.25 µL和0.5 µL）時,，目標基因的擴增在使用Genomax時被證明是成功的，而通過手動處理分離的gDNA未能產(chǎn)生任何信號（圖5）,。
圖5. 低樣品體積下,，使用手動方法和Genomax復(fù)制小鼠高甲基化癌癥1基因體的結(jié)果對比。染色體11,，75058091-75058200（109個堿基對）
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結(jié)論
自動化的均質(zhì)化和細胞裂解過程提高了處理的效率,，無論是在時間上還是在終的gDNA提取上。使用Genomax等自動化過程,，目標gDNA的質(zhì)量和數(shù)量以及復(fù)制性都顯著提高,，特別是與Spex DNAmax提取試劑盒結(jié)合使用時?？傮w而言,，使用Genomax處理樣本的時間大大減少到不到半小時，并且在較低的樣品體積下產(chǎn)生更多可復(fù)制的遺傳物質(zhì)副本,。
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