Firefly & Renilla Assay Kit（雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒）為檢測(cè)基因的表達(dá)量提供有效的手段,，在 DLR檢測(cè)中，螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測(cè)。先以螢光素（Luciferin）為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的活性,，然后加入抑制螢火蟲螢光素酶催化的物質(zhì),，同時(shí)加入腔腸素（Coelenterazine）檢測(cè)海腎螢光素酶的活性，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè),。通過(guò)螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系,，可以非常靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá),。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或 5' 啟動(dòng)子區(qū)克隆在 Luciferase 的上游,，或把 3'-UTR 區(qū)克隆在 Luciferase 的下游，構(gòu)建成報(bào)告基因（Reporter gene）質(zhì)粒,，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)螢光素酶活性的高低來(lái)判斷藥物處理等對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,。海腎螢光素酶更多地被用作檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參,，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。
        螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kD 的蛋白,，在 ATP,、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素生成氧化螢光素（Oxyluciferin）,，在螢光素被氧化的過(guò)程中,，會(huì)產(chǎn)生光信號(hào)。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kD 的蛋白,，在氧氣存在的條件下,，可以催化腔腸素氧化成腸酰胺（Coelenteramide），在腔腸素氧化的過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生光信號(hào),。本試劑盒的光信號(hào)可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀,、酶標(biāo)儀或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。該試劑盒具有檢測(cè)迅速,、靈敏度高,、檢測(cè)范圍廣，無(wú)細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn),。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
快速：細(xì)胞裂解在10-15 min內(nèi)完成,。
方便：試劑易于配制，樣品檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單,。
靈敏：能夠檢測(cè)10-20mol的螢光素酶,。
酶的濃度線性范圍可達(dá)8個(gè)數(shù)量級(jí)。
產(chǎn)品組分：

1,、細(xì)胞裂解
（1）將培養(yǎng)基移除,，加 PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細(xì)胞可直接進(jìn)行此操作,，懸浮細(xì)胞需離心收集細(xì)胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer（用無(wú)菌水按 4: 1 稀釋組分 A）,，然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min,，充分裂解細(xì)胞。
注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h,，-70℃可長(zhǎng)期存放（裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融）,。
（2）將裂解產(chǎn)物 10000-15000 rpm 離心 3-5 min，離心后將上清液移入新的 EP 管中進(jìn)行后續(xù)檢測(cè),。
注：細(xì)胞裂解后可立即檢測(cè),，也可以凍存，需要時(shí)再檢測(cè),。凍存樣品需融解至室溫再進(jìn)行檢測(cè),。
2、工作液配制
（1）將所有組分恢復(fù)至室溫,。
（2）用組分 B 充分溶解組分 C,，配制成 0.2 mg/mL 的螢火蟲螢光素酶工作液。
注：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融,，若單次實(shí)驗(yàn)用量較少,，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。
（3）用組分 D 將組分 E 稀釋成海腎螢光素酶工作液,，稀釋方法為 1 ul E 組分加入到 49 µL D 組分中,。
注：海腎螢光素酶工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。
3,、化學(xué)發(fā)光值檢測(cè)
（1）按照儀器操作說(shuō)明書開(kāi)啟具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的儀器,，如多功能酶標(biāo)儀，設(shè)定參數(shù),，測(cè)定時(shí)間為 10 s,，測(cè)定間隔為2 s。
（2）每個(gè)樣品測(cè)定時(shí),，取樣品 20-100 ul（如果樣品量足夠,，請(qǐng)加入 100 ul；如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量,，但檢測(cè)孔用量需保持一致）,。1×Lysis Buffer 為空白對(duì)照。
（3）加入 100 ul 螢火蟲螢光素酶檢測(cè)液,，測(cè)定 RLU（relative light unit）值（建議酶標(biāo)儀設(shè)置 Shaking 混勻功能）,。
注：由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后,，立即進(jìn)行檢測(cè),。
（4）加入 100 ul 海腎螢光素酶工作液,，測(cè)定 RLU（relative light unit）值（建議酶標(biāo)儀設(shè)置 Shaking 混勻功能）。
（5）在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下,，用螢火蟲螢光素酶測(cè)定得到的 RLU 值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的 RLU 值,。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參,，也可以進(jìn)行類似計(jì)算。

-20℃保存,。C 組分建議預(yù)先使用無(wú)菌水配置為 2 mg/mL 儲(chǔ)液,，B 組分、D 組分及配置為儲(chǔ)液的 C 組分,，
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行小批量分裝,。所有檢測(cè)工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融,。

熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒