一,、RNA提取

 1,、樣本裂解：

 組織樣本： Trizol用量：每 50-100 mg 組織加 1 mL Trizol，樣品體積不應(yīng)超過(guò) Trizol 體積的 10％,。
（1）將動(dòng)物或植物組織切成小塊,，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有 1 mL Trizol 的 2 mL 離心管中,，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻,，置于冰上， 待所有的樣品研磨完,。
（3）裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體,。對(duì)于富含蛋白、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉,、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等,，勻漿后仍會(huì)存留有不溶物質(zhì)，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中,。

 細(xì)胞樣本：
（1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液,，每 10 cm2培養(yǎng)面積（6 孔板單孔或 35 mm 平皿）加入 1 mL Trizol，用加樣器吹打數(shù)次,，以確保細(xì)胞裂解,，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。 注：Trizol 的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面 積決定,，而非由細(xì)胞數(shù)目決定,。Trizol 量不足可能導(dǎo)致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
（2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，吸盡液體,，每 5-10×106動(dòng)植物或酵母細(xì)胞，或每 1×107細(xì)菌細(xì)胞加入 1mL Trizol,， 用加樣器吹打,，使其裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中,。 注：添加 Trizol 前切勿洗滌細(xì)胞 ,，以免 RNA 降解。必要時(shí)可以用勻漿器來(lái)裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞 ,。

2,、液相分離：

（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置 5 min，使核酸-蛋白復(fù)合物分離,。（注：此時(shí)樣品可在-80℃長(zhǎng)期保存,。 ）
（2）每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，蓋緊管蓋,，劇烈振蕩 15 s,，室溫放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 離心 15 min,，樣品會(huì)分成三層：桔黃色的下層有機(jī)相,，中間層和無(wú)色的上層水相。
（4）吸取含總 RNA 的上層水相至一新的離心管中,，吸取水相的體積為所用 Trizol 試劑的 60％,。

3、RNA 回收

（1）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 異丙醇,，顛倒數(shù)次混勻,，室溫放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 離心 10 min,，棄除上清,，可見(jiàn)膠狀的 RNA 沉淀,。
（3）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻,，洗滌沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 離心 5 min,，棄除上清,。
（5）室溫倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機(jī)，以免 RNA 過(guò)干,，難以溶解）,。
（6）加入適量（如 25uL） DEPC-ddH2O 或 TE 緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解 RNA,。
（7）通過(guò) RNA 電泳以及紫外分光光度計(jì)檢測(cè),，確定 RNA 的濃度、純度和完整性,。
（8）所得的 RNA 應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存,，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品推薦：

二,、逆轉(zhuǎn)錄

1,、去除RNA中基因組DNA殘留：

混勻，并短暫離心,，反應(yīng)條件為37℃,，5 min。
* 采用自備的序列特異性引物時(shí),，RNA 模板的量可調(diào)整為“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA”

2,、在上述的反應(yīng)管中，直接添加如下的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需組分,，進(jìn)行第一鏈cDNA 的合成步驟：

3,、輕輕混勻，短暫離心,；42℃孵育15-50 min,。注意：復(fù)雜模板逆轉(zhuǎn)錄溫度可升高至50℃，提高反轉(zhuǎn)錄效率,。
反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用場(chǎng)景做適當(dāng)調(diào)整,。如合成的cDNA 用作qPCR 模板，則反應(yīng)條件為42℃孵育15 min,。

4,、85℃加熱5 min 失活Enzyme mix。

5,、反應(yīng)結(jié)束后所得的cDNA,，請(qǐng)置于冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存。

產(chǎn)品推薦：

三、qPCR實(shí)驗(yàn)

染料法qPCR （以abs601511產(chǎn)品為例）

用戶需自備的試劑：cDNA 或 DNA 模板,、引物,、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。

請(qǐng)按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,。

操作示例：分別以20 µ l和50 µ l PCR反應(yīng)體系為例：

1,、PCR 反應(yīng)體系的建立：

注：
*模板量： 10-100 ng基因組DNA，或 1-10 ng cDNA 為參照,，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同,，可對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量,。 另外,， Two Step RT-PCR 反應(yīng)的cDNA（ RT 反應(yīng)液）作為模板時(shí)的添加量不要超過(guò) PCR 反應(yīng)液總體積的10% 。
*引物：通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結(jié)果,，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設(shè)定范圍的參考,。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度,；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系,。為了獲得理想的 qPCR 的效果,，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度建議為 80-200 bp 。
*不同儀器所需 ROX Reference Dye不同,，或需要添加或不需要添加,，請(qǐng)根據(jù)儀器說(shuō)明進(jìn)行操作。

2,、PCR 反應(yīng)條件的設(shè)置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶,，如果在PCR反應(yīng) 前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃,、2 min,，復(fù)雜或高GC模板適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內(nèi)可完成至 少300 bp的擴(kuò)增,，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實(shí)驗(yàn),；對(duì)于超過(guò)350 bp或者高GC含量的擴(kuò)增子，建議增加延伸時(shí)間至60 s或者采用三步法以提高擴(kuò)增效率,。

注 ： 以上舉例為常規(guī) qPCR反應(yīng)系統(tǒng),，僅供參考。實(shí)際反應(yīng)條件因模板,、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異 ,， 需根據(jù)模板,、引物、目的片段的特點(diǎn)設(shè)定最佳反應(yīng)條件,，并根據(jù)比例放大或縮小反應(yīng)體系,。

3、在相應(yīng)的 Real Time PCR 儀器上完成實(shí)驗(yàn),，并分析結(jié)果,。

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