MDA-MB-453-LUC(人乳腺癌細(xì)胞-熒光素酶標(biāo)記)

細(xì)胞篩選：

該細(xì)胞為已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LUC的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,，其LUC熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度,，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選,。

細(xì)胞經(jīng)過(guò)20μg/ml嘌呤霉素篩選，平時(shí)培養(yǎng)可維持10μg/ml嘌呤霉素

二,、細(xì)胞接收后的處理

1) 收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于室溫放置約1h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2) 請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3) 半貼細(xì)胞和貼壁不牢（懸浮）細(xì)胞：T25瓶置于室溫放置約1h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況,，若細(xì)胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用培養(yǎng)基重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),，若細(xì)胞生長(zhǎng)80%-90%對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代,，傳代時(shí)需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收,。

4) 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 ,。

三、細(xì)胞培養(yǎng)操作

1) 復(fù)蘇細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含8mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心5min,，棄去上清液,，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度,。

2) 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

【該細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞,，傳代可以參考以下方法：】

a) 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤(rùn)洗后細(xì)胞會(huì)脫落所以PBS也要回收到離心管中。

b) 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間）,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入5-6ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化,。

c) 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來(lái)的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min,，棄去上清,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行,。

3) 細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為例,；

a) 收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS,，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。

b) 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度1×10^6~1×10^7/mL,，輕輕混勻,，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí),。

c) 將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

四,、培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1) 細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，予以重發(fā)情況

a) 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問(wèn)題,，細(xì)胞丟失,、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,，重發(fā),；

b) 細(xì)胞污染問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品3 天內(nèi),，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，核實(shí)后重發(fā)；

c) 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2小時(shí)后,，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2 天后,，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）,，重發(fā),；

d) 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后2天后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置2 小時(shí)候并且未開封，出現(xiàn)污染,，重發(fā),；

e) 細(xì)胞活性問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，和每天的細(xì)胞照片，核實(shí)后予重發(fā),；

f) 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3 天請(qǐng)拍照,，3 天未告知的，視為產(chǎn)品合格,。4-7 天內(nèi)出現(xiàn)問(wèn)題需提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題的照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟,，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā),。 

2) 細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，不予以重發(fā)的情況

a) 客戶操作造成細(xì)胞污染,，不重發(fā),；

b) 客戶嚴(yán)重操作失誤致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

c) 非我們推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；

d) 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供真實(shí)清晰的培養(yǎng)前3 天的細(xì)胞狀態(tài)照片,，不重發(fā)；

e) 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題的,，不重發(fā),；

f) 收到細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)問(wèn)題與客服人員溝通的時(shí)間證明大于7 天的，不重發(fā),；

g) 視具體情況而定

五,、注意事項(xiàng)

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,，并請(qǐng)注意防護(hù),，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩,。注意：凍存管浸沒(méi)在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮,。解凍時(shí),，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

3. 該細(xì)胞僅供科研使用,！說(shuō)明書僅供參考以實(shí)際到貨說(shuō)明書為準(zhǔn)！

僅用于科研,，不能用于臨床診斷,！所有產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于人或動(dòng)物的治療等任何其他用途,，不為任何個(gè)人提供產(chǎn)品和服務(wù),。以實(shí)際收貨產(chǎn)品說(shuō)明書為準(zhǔn)，網(wǎng)站說(shuō)明書僅供參考,。