MagCapture™外泌體提取試劑盒PS-WAKO

MagCapture™外泌體提取試劑盒PS-WAKO

細(xì)胞外囊泡 (EV) 在各種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用,，包括腫瘤發(fā)展、神經(jīng)變性和免疫調(diào)節(jié)等,。因此,，研究人員越來越關(guān)注開發(fā)靶向或應(yīng)用EV的療法,。并且有新研究指出可以通過操縱產(chǎn)生EV的細(xì)胞來設(shè)計分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)EV療法靶向細(xì)胞的響應(yīng),。

在本次網(wǎng)絡(luò)研討會中,，金澤大學(xué)的華山教授將介紹他關(guān)于開發(fā)調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫和不同免疫響應(yīng)的設(shè)計細(xì)胞外囊泡（designer EVs）的最新研究，并討論其應(yīng)用于臨床的可能性,。該方法能夠分離出具有更高生物活性的完整EVs,。此外，還將討論大規(guī)模生產(chǎn)EVs所需的新工具以及基于該方法的定量和定性分析,。

◆細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡是由各種組織和細(xì)胞分泌的被脂質(zhì)雙層膜所包圍的膜囊泡的總稱,。由于分泌路徑、生物合成和尺寸的不同,，細(xì)胞外囊泡分為由多囊泡和細(xì)胞膜融合分泌到細(xì)胞外的外泌體（40-200 nm）,；直接從細(xì)胞膜出芽并分泌到細(xì)胞外的微泡（200-1000 nm）；從發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中分泌的凋亡小體（1000-5000 nm）這三類,。我們可以從血液,、尿液、唾液和腦脊液等體液中觀察-到細(xì)胞外囊泡,，其中包含各種蛋白,、核酸和脂質(zhì)等，對于細(xì)胞間的信息傳遞尤為重要^1）,。

近年來,，眾多研究表明細(xì)胞外囊泡與惡性腫瘤、炎癥性疾病和神經(jīng)疾病等疾病相關(guān),，因此在探索用于疾病診斷,，預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物和面向治療的應(yīng)用研究中，細(xì)胞外囊泡備受期待^2）,。此外,，由于使用血液中細(xì)胞外囊泡的診斷屬于微創(chuàng)診斷，可減輕患者在長期觀察中的負(fù)擔(dān),，同時捕捉疾病的變化,，所以急需開發(fā)此類診斷方法。

◆神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的細(xì)胞外囊泡

隨著年齡增長,，神經(jīng)退行性疾病的患病風(fēng)險也會升高,，所以對于老齡化日漸加劇的日本來說已是不容忽視的一類疾病。關(guān)于細(xì)胞外囊泡在阿爾茨海默病,、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中作用的研究,，在近10年已取得顯著進(jìn)展,。

2006年Rajendran等人報告阿爾茨海默病病因之一的β淀粉樣蛋白存在于細(xì)胞外囊泡的內(nèi)外,，并且細(xì)胞外囊泡的特異性蛋白ALIX存在于阿爾茨海默病患者大腦內(nèi)的淀粉樣斑塊^3）,。2012年Saman等人發(fā)現(xiàn)在過度表達(dá)致病因子之一的Tau蛋白的細(xì)胞中，分泌的細(xì)胞外囊泡內(nèi)存在Tau蛋白^4）,。

筆者已確認(rèn)阿爾茨海默病患者腦組織來源的細(xì)胞外囊泡中存在的Tau蛋白中對聚集體形成非常重要的Serine396發(fā)生了磷酸化（pS396 tau）,。其與對照組比較有顯著地上升（圖1a，b）^5）,。另外,，還確認(rèn)到其Tau蛋白是以寡聚體的狀態(tài)存在于細(xì)胞外囊泡內(nèi)，作為小鼠,、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中用于傳播,，聚集Tau的種子，與細(xì)胞外囊泡共同具有著重要的功能^6）,。

此外,，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析了阿爾茨海默病的腦組織來源（蔗糖密度梯度離心法），腦脊液來源（MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS,；FUJIFILM Wako,，293-77601）的細(xì)胞外囊泡，比較ANXA5,、PTGFRN和對照組發(fā)現(xiàn)這些蛋白的表達(dá)有所上升（圖1c,，d，e）^5,，7）,。

圖1. 神經(jīng)退行性疾病中細(xì)胞外囊泡的功能和生物標(biāo)記開發(fā)

（a）透射電子顯微鏡下的細(xì)胞外囊泡 （b）存在于細(xì)胞外囊泡內(nèi)外的Tau和磷酸化Tau （c）基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白質(zhì)表達(dá)量比較 （d）阿爾茨海默病患者腦組織來源細(xì)胞外囊泡的ANXA5的表達(dá)上升 （e）腦脊液來源細(xì)胞外囊泡的生物標(biāo)記候選蛋白

CTRL：健康　　MCI：輕度認(rèn)知障礙　　AD：阿爾茨海默病性癡呆　　＊：p < 0.05

雖然使用腦脊液監(jiān)測疾病是優(yōu)選,，但提取腦脊液對患者來說負(fù)擔(dān)沉重,，所以希望能有微創(chuàng)的血液檢查。因此筆者等人考慮使用多個檢測樣品的血液樣品細(xì)胞外囊泡分析和評估候選蛋白,，為了同時處理多個樣品,，并且消除人工操作的誤差，我們開發(fā)了可自動純化體液來源細(xì)胞外囊泡的技術(shù),。

◆血清和血漿來源細(xì)胞外囊泡的自動純化技術(shù)開發(fā)

體液中含有大量的細(xì)胞外囊泡,，考慮到其還包含了來源細(xì)胞的變化，因此使用大規(guī)模的臨床檢測樣品進(jìn)行細(xì)胞外囊泡蛋白的全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析正在盛行,。至今已報告許多從血液中濃縮細(xì)胞外囊泡的方法,，例如組合式離心法、平衡密度梯度離心法,、尺寸排阻色譜法,、利用親和性的純化法等^8）。

由于不同方法分分離的細(xì)胞外囊泡也各異,，而且含有雜質(zhì)的比例也不同,，所以可高純度純化細(xì)胞外囊泡的方法,，以及標(biāo)準(zhǔn)化純化方法非常必要。

高純度純化和濃縮細(xì)胞外囊泡可以降低蛋白的動態(tài)范圍,，能夠在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中定性和定量微量蛋白,。此外，為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模臨床樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,，開發(fā)重復(fù)性高的純化系統(tǒng)尤為重要,。

筆者等人通過使用96孔正壓萃取裝置對 96 份血清和血漿樣品進(jìn)行過濾前處理，并在 KingFisher Flex系統(tǒng)上使用了 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS,，成功開發(fā)了一次性純化96份樣品的自動純化技術(shù)（圖2）,。

圖2. 使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS開發(fā)細(xì)胞外囊泡的自動純化技術(shù)

◆血清和血液細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

筆者等人在通過對自動純化技術(shù)純化的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行了全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與手動純化相比,，自動純化技術(shù)可以降低樣品間的差異,，在提高細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物的離子強(qiáng)度的同時，還能大幅度降低血液蛋白中的載脂蛋白B的離子強(qiáng)度（圖3a）,。

使用臨床樣品的分析中,，成功定性了細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物在內(nèi)的4079種蛋白，發(fā)現(xiàn)血清和血漿來源的細(xì)胞外囊泡中有部分蛋白的定量值差異較大（圖3b）^11）,。需要根據(jù)研究目的選擇血清或血漿中的評估用蛋白,。

圖3. 自動純化的血清和血漿來源細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

（a）手動和自動純化的細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物的比較 （b）血清和血漿來源細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果

目前，研究人員使用自動純化技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模臨床樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,，成功定性了腦組織來源細(xì)胞外囊泡的候選特異性標(biāo)志物蛋白^11）,。

◆結(jié)語

液體活檢可以從含有血液或尿液的體液中檢測或監(jiān)測癌癥、退行性疾病和傳染病等,，是一種備受期待的檢測,、監(jiān)測方法，因此將細(xì)胞外囊泡應(yīng)用于液體活檢也備受矚目,，期待今后可以得到進(jìn)一步的研究和開發(fā),。血液細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，不僅在標(biāo)志物的探索,，在闡明病理的機(jī)制中也能發(fā)揮作用,，對于大規(guī)模臨床樣品分析有著重要作用。

本次我們開發(fā)的自動純化技術(shù)可同時處理多個樣品,，重復(fù)性優(yōu)異,，還可以抑制血液蛋白的污染。此外,，我們還實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學(xué)分析前處理的自動化（論文投稿中）,，有望為疾病生物標(biāo)志物探索以及診斷試劑盒的開發(fā)提供新的技術(shù)。

◆謝辭

神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞外囊泡的研究是在波士頓大學(xué)（現(xiàn)Mayo clinic）池津庸哉老師的帶領(lǐng)下進(jìn)行的,，細(xì)胞外囊泡的自動化純化是在富士膠片和光純藥株式會社的協(xié)助下在醫(yī)藥基礎(chǔ)研究所進(jìn)行的,。在此,，表示衷心地感謝。