β-羥基丁酸（BHB）是一種在長時間禁食,、低碳水化合物攝入或劇烈運動期間產(chǎn)生的酮體,。作為能量代謝和燃料利用中的關(guān)鍵參與者,，BHB在葡萄糖供應(yīng)受限,，為大腦,、心臟和骨骼肌等多種組織提供替代能量來源,。BHB還作為一種信號分子，影響基因表達,、氧化應(yīng)激,、炎癥和其他細(xì)胞過程。其代謝意義不僅限于能量供應(yīng),，還涉及多種生理和病理過程,。AkrivisBio的BHB檢測試劑盒是一種簡單、靈敏的BHB含量測定方法,。在檢測中,，BHB被氧化生成NADH，隨后NADH用于將四氮雜卓還原為具有450納米吸收峰的高色素甲臜,。該檢測的靈敏度適用于測量低至10微摩爾的BHB樣本,。

艾美捷β-羥基丁酸測定試劑盒：

貨號：MA-0132

規(guī)格：100孔

樣本類型：血清,、血漿,、細(xì)胞裂解液、組織提取液,、尿液,、細(xì)胞培養(yǎng)基

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測方法：比色法，檢測波長405納米

檢測類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法檢測,，用于定量檢測廣泛樣本中的胰蛋白酶活性,。

靈敏度：0.05-0.1mU

儲存條件：4°C

運輸條件：凝膠冷藏包

β-羥基丁酸測定試劑盒檢測組分：

-檢測緩沖液：25毫升，貨號WMMA-0132-A

-β-羥基丁酸脫氫酶：凍干粉,，綠色,，貨號MA-0132-B

-NAD/四氮雜卓混合液：凍干粉，紅色,，貨號MA-0132-C

-β-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉,，黃色，貨號MA-0132-D

β-羥基丁酸測定試劑盒檢測原理：

1.β-羥基丁酸脫氫酶將BHB氧化為乙酰乙酸,，生成NADH,。

2.NADH將電子轉(zhuǎn)移至四氮雜卓，將其轉(zhuǎn)化為甲臜,。

儲存和處理：

在使用前將試劑盒儲存于-20°C,。使用前將檢測組分恢復(fù)至室溫。打開試劑瓶前請短暫離心,。

-檢測緩沖液：直接使用,，儲存于4°C。

-β-羥基丁酸脫氫酶：用220微升檢測緩沖液溶解,。使用時保持在冰上,，儲存于-20°C,。

-NAD/四氮雜卓混合液：用220微升檢測緩沖液溶解，儲存于-20°C,。

-β-HB標(biāo)準(zhǔn)品：用100微升去離子水溶解,，配制成10mM的溶液，儲存于-20°C,。

檢測步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至90微升去離子水中,，配制成0.4mM的工作溶液。將0,、5,、10、15,、20,、25微升的工作溶液分別轉(zhuǎn)移至96孔板的多個孔中，用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,，得到每孔0,、2、4,、6,、8、10納摩爾的BHB標(biāo)準(zhǔn)系列,。

2.樣本準(zhǔn)備：體液中的β-HB含量差異較大（血清中為20微摩爾-5毫摩爾）,，尿液中可能更高。血液和尿液中的還原物質(zhì)可能會干擾檢測,。使用10kDa離心過濾器可以減少這種干擾,。向測試孔中加入1-50微升樣本，用檢測緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升,。

-注意事項：

-還原物質(zhì)和其他所謂的基質(zhì)效應(yīng)可以輕松處理,。請參閱下一頁，了解處理顯著干擾檢測的方法,。

-在極少數(shù)情況下,，樣本中存在還原型吡啶核苷酸NAD(P)H，可能會干擾檢測,。在這種情況下,，運行一個背景對照，用2微升檢測緩沖液代替β-HB脫氫酶,。從配對樣本中減去這個背景值,，以獲得校正后的β-HB讀數(shù)。

-所有樣本讀數(shù)必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),。如果讀數(shù)超出此范圍,，請稀釋樣本并重新運行,。

3.啟動反應(yīng)：每個反應(yīng)需要50微升反應(yīng)混合液。根據(jù)要運行的總孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液：

-反應(yīng)混合液：

-檢測緩沖液：46微升

-β-HB脫氫酶：2微升

-NAD/四氮雜卓混合液：2微升

-背景對照混合液：

-檢測緩沖液：48微升

-NAD/四氮雜卓混合液：2微升

-向含有β-HB標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的每個孔中加入50微升反應(yīng)混合液,。

4.測量：在450納米處監(jiān)測反應(yīng)30分鐘,。標(biāo)準(zhǔn)品會迅速顯色，但樣本的顯色可能會更慢,。

5.計算：

-從所有標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)中減去0BHB標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù),。繪制背景校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

-確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,，這將用于定義未知樣本中的BHB含量,。通過從配對樣本中減去任何背景對照來校正未知樣本。將校正后的樣本讀數(shù)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,，以獲得樣本孔中的BHB納摩爾數(shù),。

-將這些值轉(zhuǎn)換回原始樣本中的BHB含量：

-A.孔中的BHB納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=樣本中的BHB納摩爾數(shù)/微升

-B.樣本中的BHB納摩爾數(shù)/微升×樣本體積=樣本中的總BHB納摩爾數(shù)

-C.如果樣本因信號過高而稀釋，請乘以稀釋因子,。

-注意：許多代謝物和其他化學(xué)物質(zhì)可能會顯著干擾各種反應(yīng)化學(xué),。為了更精確的測定，請在有無恒定量樣本的情況下進行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定,。不必運行所有六個標(biāo)準(zhǔn)品,；至少使用3個（0-10-20微升）來驗證吸光度響應(yīng)與分析物量呈線性關(guān)系,。兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)相同,。它們之間的吸光度偏差歸因于樣本中的分析物量（在本例中為β-羥基丁酸）。如果兩個斜率不同,，則存在基質(zhì)效應(yīng)影響反應(yīng)化學(xué),。在這種情況下，確定0標(biāo)準(zhǔn)品之間的吸光度差異,，并將其應(yīng)用于在樣本存在下運行的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,。

具有大矩陣效應(yīng)的樣品示例：

-0標(biāo)準(zhǔn)品之間的差異為0.35。在樣本存在下的斜率為0.226OD/納摩爾,。

-樣本中具有基質(zhì)效應(yīng)的分析物量=0.35OD/0.226OD/納摩爾=1.55納摩爾