豬藍耳病毒經(jīng)典株實時熒光PCR試劑盒說明書

本試劑盒針對豬藍耳病毒經(jīng)典株的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，在反應體系中含豬藍耳病毒經(jīng)典株基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含豬藍耳病毒經(jīng)典株靶基因的質(zhì)粒,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復凍融，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 ,、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

2.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨,，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。

3.應避免標本間交叉污染,。

4.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃以下,，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³ Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,；

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；

3. 各區(qū)域物品均為專用,，不得交叉使用,，以免污染；檢測結(jié)束后,，應立即對工作臺清潔,；

4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前,，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確,；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),，并單獨存放,；

7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,；

8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應管,，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒,；

9. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用,。