BaEV 基因拷貝數(shù)檢測試劑盒（qPCR 熒光探針法）說明書

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機(jī)型使用時(shí),，請注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準(zhǔn)備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機(jī)
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL,，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL,，200μL，10μL,，2.5μL 等）

操作步驟：

一,、 樣品前處理

詳見血液 / 組織 / 細(xì)胞基因組 DNA 純化提取試劑盒（貨號為 HG-NA100）操作說明書。

二,、qPCR 操作步驟

1. 定量參考品及 NTC/NCS 的制備

1.1 定量參考品：取出BaEV定量參考品,、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后,，輕微振蕩混勻,，瞬時(shí)離心；

1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管,，分別標(biāo)記為 ST0,，ST1，ST2,，ST3,，ST4，ST5,，ST6,；

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程如下表：

1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；

1.5 NCS 的制備 : 隨樣品取 100μL DNA 稀釋液進(jìn)行樣品預(yù)處理,。

2. q-PCR 反應(yīng)液的制備和加樣

2.1 根據(jù)所需檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品數(shù)量（一般做 3 個(gè)復(fù)孔）,，計(jì)算所需孔數(shù)：

    反應(yīng)孔數(shù) =（6 個(gè)濃度梯度的標(biāo)曲 +2 個(gè)陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3

2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR Mix 總量：

    qPCR Mix =（反應(yīng)孔數(shù) +2 或 3）× 15μL（2 或 3 為操作損失量）

2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻,，按下表所示配制 qPCR Mix,。

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積20μL）：

各反應(yīng)孔加樣示例

4.實(shí)驗(yàn)需使用qPCR實(shí)驗(yàn)專用的八聯(lián)管或者96孔板進(jìn)行反應(yīng),，需去除反應(yīng)體系中的氣泡,，并離心將液體離至管底準(zhǔn)備反應(yīng)。
5.反應(yīng)孔排版示例

96孔板排版示例

三,、 qPCR反應(yīng)程序和參數(shù)設(shè)置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例,。）

1.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序，設(shè)置兩步法反應(yīng)程序如下表：

2.創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)反應(yīng)板,，點(diǎn)擊Select Fluorophores選擇熒光FAM,；在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔,，在Sample Type中下拉選擇Unknow,，勾選熒光FAM，Target Name命名為BaEV,；輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name,；

3.在反應(yīng)板圖表中，選擇標(biāo)曲孔,，在Sample Type中下拉選擇Standard,，勾選熒光FAM，Target Name命名為BaEV,；輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name,。分別在ST1、ST2,、ST3,、ST4、ST5,、ST6的Concentration一欄賦值為2.00E+06,、2.00E+05、2.00E+04,、2.00E+03,、2.00E+02、2.00E+01（單位為copies/μL）,。

4.點(diǎn)擊Run界面“Start Run”按鈕進(jìn)行PCR測定,。

四、 qPCR結(jié)果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點(diǎn)擊資料分析視窗 Quantitation,，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）,、截距（Intercept）、擴(kuò)增效率（Effect）,、R²,。
2. 在視窗 Quantitation Data 中,，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照 NTC、NCS,、待測樣本的檢測值,，單位為 copies/μL,。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個(gè)平行孔間 Ct 值差應(yīng)小于 1.0,，Ct 值大于 35 的孔除外；
• 陰性對照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應(yīng)大于標(biāo)曲最I(lǐng)低濃度的 CT 值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn),；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù) R² ≥ 0.98,，擴(kuò)增效率 85%~110% 之間；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標(biāo)回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3,。

4. BaEV 陰性判定標(biāo)準(zhǔn) : 樣本 3 個(gè)平行孔無 Ct 值或有 2 個(gè)孔無 Ct 值和 1 個(gè)孔有 Ct 值且檢出孔的 Ct 值大于 LLOQ 的 Ct值,。

5.BaEV 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) : 樣本 2 個(gè)或以上孔檢出 BaEV 基因拷貝數(shù)不低于 10copies/uL，判定為 BaEV 基因陽性,。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證,，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域,，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作,，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩,、手套和穿好潔凈服,。
3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染,，避免長時(shí)開蓋,。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用,。
6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法,，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測效果。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),。
9. 公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé),，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,，預(yù)留充足的樣本,。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷,。