凋亡因子Caspase-389檢測實(shí)驗(yàn)

Caspase3

Caspase是- -個在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族,。Caspase3也稱CPP32, 是細(xì)胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶,，可以剪切procaspase2.6. 7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase底物,，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin和fodrin等,。 這些由caspase 3介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。caspase 3在細(xì)胞核凋亡過程中也起到了關(guān)鍵作用,，包括染色質(zhì)固

縮,，DNA的**片段化等。同時caspase 3對細(xì)胞起泡(Cell blebbing)也起到關(guān)鍵作用,。

檢測原理基于casepase 3可以催化底物AC-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA(-itroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3的活性,。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。參照黃色產(chǎn)物pNA制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，可以作為定量caspase 3酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品,。

Caspase-8

Caspase 8通常以酶原的形式存在，在細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中被激活,，Caspase 8被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中上游的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 過程中caspase 8被激活,形成一個由p18和p10組成的二聚體,，進(jìn)一步激活下游的caspase 4, caspase 6。caspase 9和caspase 10,。本方法基于Caspase 8可以催化底物AC-IETD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA (-nitraniline),從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 8的活性,。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。 檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，可以計算樣品的Caspase 8酶活性,。

Caspase-9

Caspase 9也稱ICE-LAP6或Mch6,是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中上游的caspase。線粒體釋放細(xì)胞色素c以后,，caspase 9可以和細(xì)胞色素c以及Apaf1形成復(fù)合物,，同時被激活。激活的caspase 9可以激活細(xì)胞凋的關(guān)鍵酶caspase 3,從而促進(jìn)后續(xù)的細(xì)胞凋亡信號,。Caspase 9的激活可以通過磷酸化進(jìn)行調(diào)控,。

本方法基于Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA產(chǎn)“生黃色的pNA (p-nitroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測

Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收,。檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，可以計算樣品的Caspase 9酶活性,。

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

凋亡因子Caspase 3/8/9檢測樣本準(zhǔn)備:

1)細(xì)胞樣品:取1x107個細(xì)胞(約1個T25的培養(yǎng)瓶細(xì)胞量) , 600g 4°C離心5分鐘收集細(xì)胞，小心吸除上清,，PBS洗滌一次,。吸取上清后，每管細(xì)胞樣品加入100u|裂解液重懸沉淀,冰浴裂解15分鐘,。4°C 16,000g離心10-15分鐘,， 把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存樣品,。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度,，盡量使蛋白濃度達(dá)到1-3mg/ml.

2)組織樣品:約每10mg組織加入100ul裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿,。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1 .5ml)離心管中,，冰浴再裂解5分鐘。4°C 16,000g離心10-15分鐘,，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中,。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存

樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度,，盡量使蛋白濃度達(dá)到1-3mg/ml.

Caspase-3活性檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)周期: 7-10個工作日內(nèi)完成,，重復(fù)檢測優(yōu)惠。

客戶注意事項(xiàng)

1.抗體:事先咨詢上海研謹(jǐn)生物,，明確抗體種屬以及是否有該抗體可使用,。如無可由雙方協(xié)商而定，客戶自己購買提供或我公司代購;

2.標(biāo)本收集與保存:

①組織樣品:新鮮組織放入液氮或70度保存,組織不少于100mg (約綠豆大小) ;

②培養(yǎng)細(xì)胞:通過細(xì)胞計數(shù)取不少于000000個細(xì)胞于EP管,，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑,，混勻后保存于冰箱(-70°C，避免反復(fù)凍融) ;

③血液細(xì)胞標(biāo)本:以抗凝管保存血樣或以淋巴細(xì)胞分離液分離細(xì)胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑,，保存(-70°C可長期保存,，避免反復(fù)凍融)

④血清或細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本:離心去掉雜質(zhì)后取上清入EP管，保存(以上4°C可保存15-20天,，-70°C可長期保存,，避免反復(fù)凍融)

3、樣本運(yùn)輸:可選以下任何的一種方式寄送標(biāo)本

①組織樣本,、細(xì)胞樣本以干冰運(yùn)輸或加入蛋白保護(hù)劑后加冰袋運(yùn)輸;

②細(xì)胞樣本也可以直接快件寄送培養(yǎng)瓶(密封保證不污染,，培養(yǎng)液不漏出,細(xì)胞不要長得太滿，50%左右,灌滿培養(yǎng)液) ;

③血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保證液體不漏出,，視路途遠(yuǎn)近2-3天可到達(dá)),。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：