A431-A人表皮癌細(xì)胞

【背景資料】 見細(xì)胞說明書

【產(chǎn)品來源】 細(xì)胞主要來源ATCC、DSMZ,、ECACC,、RIKEN、promocell,、ScienCell,、ECACC、JCRB,、KCLB,、Asterand、ICLC以及少數(shù)國內(nèi)外著名大學(xué)建系

"公司提供貼壁,、半貼壁,、懸浮、半懸浮,、貼壁與懸浮混合等細(xì)胞特性,，一般細(xì)胞培養(yǎng)PBS量是10%，如果出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不良情況,，可以提高PBS量到15%,，SHEE人永生化食管上皮細(xì)胞待細(xì)胞穩(wěn)定后,，調(diào)回PBS量10%，對于初次實驗者,，一般細(xì)胞培養(yǎng),，都需要加入雙抗防止細(xì)胞污染，細(xì)胞匯合度達(dá)到90%,，我們開始寄送,，這樣可以保持細(xì)胞收到時，良好的細(xì)胞活力,。

一,、售前
         杭州仟諾生物專業(yè)為國內(nèi)科研提供高品質(zhì)細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)服務(wù)，QC檢測合格后發(fā)貨保證細(xì)胞狀態(tài)良好,，發(fā)貨前保證質(zhì)量,。
 
二、售后
         收到細(xì)胞7天內(nèi)出現(xiàn)狀態(tài)不佳等情況請及時反饋,，會有技術(shù)同步指導(dǎo)操作協(xié)助解決,，如仍未養(yǎng)活免費重發(fā)。建議及時保種,，有備無患,！
 
三、細(xì)胞生長條件：

 
四、細(xì)胞收到后處理
    細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿*培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運輸?shù)?/span>zui好辦法,。收到細(xì)胞回到自己的實驗室后,，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi),，嚴(yán)格無菌操作。鏡下觀察：未超過80%匯合度時,，可將瓶裝的*培養(yǎng)液移入廢液缸中,，原瓶（T25瓶）保留6-8ml*培養(yǎng)液,，懸浮細(xì)胞需離心處理,，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),；超過80%匯合度時,，根據(jù)情況傳代或者凍存,，具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
 
五,、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中，加入約6ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。
 
1、貼壁細(xì)胞,，傳代參考如下：
①. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。
②. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。
③. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
 
④. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

2,、懸浮細(xì)胞，傳代參考如下：

方法①：收集細(xì)胞,，1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
方法②：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,，將剩余細(xì)胞懸起,，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
 
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。貼壁細(xì)胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后,，進(jìn)行離心收集,，1000RPM條件下離心5分鐘，去除上清,，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO,，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。
 

A431-A人表皮癌細(xì)胞

   剛收到細(xì)胞時,，胎牛血清可以用15%培養(yǎng)兩三天,，利于細(xì)胞盡快恢復(fù)狀態(tài)，細(xì)胞穩(wěn)定后
再調(diào)回10%即可
   收到細(xì)胞后如細(xì)胞狀態(tài)不佳,，或培養(yǎng)中遇到問題,，煩請當(dāng)天盡快聯(lián)系，以便處理,。當(dāng)天及時反饋細(xì)胞情況和細(xì)胞照片是售后跟蹤處理重要參考依據(jù),，請您務(wù)必重視。

1. 為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時傳代,？
    答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性,，也就是說當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時候，它就會停止生長,，及時傳代后,，細(xì)胞的生長得以繼續(xù)。
2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些,？其解決辦法是什么,？
    答：通常細(xì)胞生長得非常快時,，pH值通常下降得很快,。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決,。此外,，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠,、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌,、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快,。
       (1)按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5％到10％,。
       (2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液,。
       (3)松開瓶蓋1/4 圈,。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。
       (4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液,，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液,。
       (5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
3.培養(yǎng)液pH對細(xì)胞生長的影響,？
    答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4,，偏離此范圍可能對細(xì)胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對pH的要求也不*相同,，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動耐受差,，無限細(xì)胞系耐受力強。但總體來說,，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強一些,。在配制培養(yǎng)用液時，需要注意一點：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時,，溶液的pH還會向上浮動0.2左右,。
4.購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形,？
    答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷,，以及細(xì)胞流失,。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。但對于DMSO敏感的細(xì)胞,，還是復(fù)蘇細(xì)胞時，用離心去除DMSO比較好,。
5.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因,？
    答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜,，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤,；冷凍細(xì)胞解凍后,，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,；培養(yǎng)溫度使用錯誤,；細(xì)胞置于–80 ℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作,。
6.支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響,？
    答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù),。故進(jìn)行實驗前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義,。
7.冷凍保存細(xì)胞之方法,？
    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃(30－60 分鐘)→-20℃( 30 分鐘) → -80℃(16－18 小時或隔夜)→ 液氮罐長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下,， 再放入液氮中長期儲存,。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大,，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些,。
 
8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理,？
    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可,。若培養(yǎng)液太多時可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中,，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可,。
9.欲將一般動物細(xì)胞離心下來,，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
    答：欲回收動物細(xì)胞,，其離心速率一般為300×g (約1,000rpm),，5 - 10 分鐘，過高之轉(zhuǎn)速過長時間都將造成細(xì)胞死亡,。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對離心決定,。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中 r為離心機轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離,；rpm為離心機每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù),；RCF(relative eentrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示表示單位,。
10.培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%還是10%CO2,，或者根本沒有影響？
    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度,。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時,，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時,，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
11.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,，是否應(yīng)馬上去除DMSO,？
    答：除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),，在解凍之后,，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可,，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題,。
12.冷凍管應(yīng)如何解凍？
    答：取出冷凍管后,，須立即放入37℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意,，需殘留一小塊冰塊,，就可拿到超凈工作臺操作細(xì)胞，用75％消毒凍存管,，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶,。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全,，預(yù)防冷凍管之爆裂

13.如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞,？

    答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合后,，用移液槍點樣到血球計數(shù)板,，置于倒置顯微鏡下觀察、計數(shù),，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞,，因活細(xì)胞排斥臺盼蘭，不被染色,。
14.細(xì)胞欲冷凍保存時,，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
    答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial,。
15.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？
    答：動物細(xì)胞冷凍保存時常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,，必須使用前先行配制完成,。
16.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
    答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時,，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先，確定污染物是細(xì)菌,、真菌,、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,，檢查HEPA過濾器。
　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性,，因而,，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要,。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟,。
1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞,，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度,。