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懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟及優(yōu)化注意事項(xiàng)
懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴支持物表面,，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng),，如淋巴細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常會(huì)遇到懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,，其和貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染有很大的不同。
懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染通?？赡苡龅剑?/div>
1.效率明顯低于貼壁細(xì)胞,。
2.細(xì)胞不易培養(yǎng)，死亡率高。
3.轉(zhuǎn)染試劑毒性大,，細(xì)胞死亡加劇這三種問(wèn)題,，為了提高懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，可以使用毒性較小的非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑,，也可以使用電轉(zhuǎn)染方法,，提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，電擊對(duì)細(xì)胞有一定的損傷,，最好選用具有細(xì)胞膜修復(fù)功能的電轉(zhuǎn)染試劑,，可以將電擊對(duì)細(xì)胞的傷害降到。
轉(zhuǎn)染過(guò)程中,，操作步驟一定要謹(jǐn)慎,。
以24孔板siRNA轉(zhuǎn)染為例
1.提前1天細(xì)胞種植
懸浮細(xì)胞：采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，數(shù)量為常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的1/3進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),。如某細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)是6×10^5,，那么就用2×10^5的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2.轉(zhuǎn)染過(guò)程
?、湃?.67μg(50pmol)的siRNA,，加入一定量無(wú)血清稀釋液，充分混勻,，制成RNA稀釋液,，終體積為25μl。
注意：無(wú)血清稀釋液建議采用OPTI-MEM,、無(wú)血清DMEM或1640,。
⑵取1μl的Entranster-R4000,，然后加入24μl無(wú)血清稀釋液體,，充分混勻，制成Entranster-R4000稀釋液,，終體積為25μl,。室溫靜置5分鐘。
?、菍ntranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上）混合,，室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成,。
?、葘?0μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45ml全培養(yǎng)基（可含10%血清和抗生素）的細(xì)胞上，前后移動(dòng)培養(yǎng)皿,，混合均勻,。
注意：對(duì)本試劑,，采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。
?、赊D(zhuǎn)染后6小時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài),，如狀態(tài)良好可不必更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時(shí)得到結(jié)果,。
注意：1.siRNA轉(zhuǎn)染后,，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)在mRNA水平得到結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時(shí)在蛋白水平得到結(jié)果,。mRNA轉(zhuǎn)染后,，根據(jù)需要在24小時(shí)后得到結(jié)果。
2.在部分實(shí)驗(yàn)室,，由于血清和培養(yǎng)條件等差異,，轉(zhuǎn)染后鏡下培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)少量黑點(diǎn)狀沉淀，為轉(zhuǎn)染試劑和血清中蛋白結(jié)合產(chǎn)物,，不影響轉(zhuǎn)染結(jié)果和細(xì)胞狀態(tài),，可通過(guò)換液除去。
如遇轉(zhuǎn)染效果不佳,，可采取優(yōu)化方案對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化：
1.優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：轉(zhuǎn)染試劑的用量,、DNA密度、細(xì)胞密度,、試劑和DNA混合孵育時(shí)間等等,。
2.同時(shí)細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因,。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無(wú)菌,。分享一個(gè)小秘訣：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀,，這樣就除菌了,。
3.轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2μg以上,。如果質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),，需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。
4.一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,。如果是貼壁細(xì)胞的話,，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話,，應(yīng)該是6×10^5個(gè)/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前一天換液,，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。
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