1,5-AG ELISA試劑盒

尊敬的客戶,，感謝你選用本公司的產(chǎn)品,。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測(cè)其它血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液,、組織等中天然和重組的1,5-AG濃度,。檢測(cè)其他特殊樣本請(qǐng)咨詢本公司技術(shù)支持。試劑盒僅供科研使用,。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑盒組分,。如有疑問(wèn)，請(qǐng)聯(lián)系及時(shí)與我們聯(lián)系,。

本試劑盒采用雙抗體夾心法,，雙抗體夾心原理，是基于要測(cè)試的抗原具有二價(jià)以上的特性,，能識(shí)別包被抗體，同時(shí)能識(shí)別檢測(cè)抗體,，具體過(guò)程如下：

將特異性抗體與固相載體連接,，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),，并用無(wú)關(guān)蛋白封閉空余結(jié)合位點(diǎn),。

加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),。

加生物素標(biāo)記抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與生物素標(biāo)記抗體結(jié)合,。洗滌未結(jié)合的生物素標(biāo)記抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素,，使生物素標(biāo)記抗體與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素結(jié)合,。洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)記物。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān),。

加入底物顯色,，即可計(jì)算標(biāo)本濃度。

注：一個(gè)抗體分子上可以標(biāo)記上若干個(gè)生物素分子,，一個(gè)生物素分子可以結(jié)合一個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,，從而帶來(lái)了大量的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到抗體上，比傳統(tǒng)的直接辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體具有更高的敏感性和放大效應(yīng),。

[1,5-AG酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)原理]：

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法,。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為抗1,5-AG單克隆抗體,。檢測(cè)相抗體為多克隆抗體,，經(jīng)生物素（biotin）標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān),。

[1,5-AG酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)原理示意圖]：

[試劑盒組成]：

[試驗(yàn)所需自備試驗(yàn)設(shè)備和器材]：

酶標(biāo)儀(450nm檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片,，570nm或630nm校正波長(zhǎng)濾光片)。

洗板機(jī)（可調(diào)注液量,，保證每孔350μl洗液而不溢出）,。

超凈工作臺(tái)，生物安全柜,，通風(fēng)柜,。

高精度單道加液器（量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl).

高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).

37℃恒溫箱,。

低溫離心機(jī),。

電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.

分析天平。

剪刀，鑷子,，鉗子等,。

漩渦混合儀，低頻振蕩器等,。

[試驗(yàn)所需自備試驗(yàn)耗材及試劑]：

離心管（容量為1.5ml,，5ml等）。

一次性吸頭（量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.

純凈水或蒸餾水,。

坐標(biāo)紙,。

吸水紙。

EDTA,，枸櫞酸鈉,，肝素

[標(biāo)本收集注意事項(xiàng)]：

收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管,。

血清和血漿避免使用溶血,，高血脂標(biāo)本。

標(biāo)本應(yīng)清澈透明,，懸浮物應(yīng)離心去除,。

標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，需按一次使用量分裝,，凍存于-20℃,，-80℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融,。

可根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際情況,，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)),。

收集標(biāo)本,，盡量做到雙份的用量，避免一次實(shí)驗(yàn)失敗,，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本缺失,，從而耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

收集標(biāo)本時(shí),，應(yīng)該做好防護(hù)措施（比如戴手套,，口罩，護(hù)目鏡等）,，認(rèn)為所有標(biāo)本都具有一定的潛在危險(xiǎn)性,。

樣本處理應(yīng)該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜,。

[標(biāo)本處理辦法]：

血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過(guò)夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試,，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存,。

血漿：用EDTA，枸櫞酸鈉,，肝素等作為抗凝劑,，加入血液混勻后，1000-3000rpm離心10分鐘,，取上清立即測(cè)試,，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存。

組織勻漿：切取組織塊,，0.01MPBS中過(guò)洗一次,；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿,。勻漿完成后,，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試,，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存,。

細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測(cè)試,，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃（3-6個(gè)月）保存,。

尿液，腹水,，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘,，取上清立即測(cè)試，暫時(shí)不測(cè)可以放入-20℃（1-3個(gè)月）或-80℃3-6個(gè)月）保存,。

注：樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量,，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的最佳檢測(cè)范圍,。樣品的稀釋?xiě)?yīng)有詳細(xì)記錄,。

[注意事項(xiàng)]：

試劑盒使用前請(qǐng)保存在2-8℃。除復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品,，其他成分不可凍結(jié),。

濃縮生物素化1,5-AG抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小,，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置,，會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請(qǐng)用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘,，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。

濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶全部溶解后再配制洗滌液,。

測(cè)試過(guò)程中,，1,5-AG凍干標(biāo)準(zhǔn)品為一次性使用，不得分裝,。因其濃度較低,，溶解兩小時(shí)候后，會(huì)迅速失活,。

操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

配制試劑時(shí),，要用旋渦混合儀混勻,。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y(cè)試結(jié)果尤為重要,，使用微量振蕩器(使用zui低頻率),，如無(wú)微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板1分鐘,，例如做圓周動(dòng)作,，使加入孔中的反應(yīng)液混勻。

實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀應(yīng)嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作,，并在使用前充分預(yù)熱,。

酶免試驗(yàn)中1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作復(fù)孔。

將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中,，置2-8℃保存,。

顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。

超過(guò)使用日期的試劑盒不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中,。

試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí),，波長(zhǎng)應(yīng)該設(shè)置為450nm和630nm.

所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸,，使用時(shí)必須注意安全,。

各步驟加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校準(zhǔn)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

每次試驗(yàn)測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔最高濃度的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。

不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

以洗板機(jī)洗板時(shí),每孔注液量不應(yīng)少于350μl,注意檢查加樣頭是否堵塞,。手工洗板時(shí),用帶紙屑的吸水材料應(yīng)慎重,防止外源性過(guò)氧化物酶類(lèi)似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應(yīng),。

用終止液終止反應(yīng)后，請(qǐng)于10分鐘內(nèi)讀取OD值,。

進(jìn)行復(fù)孔實(shí)驗(yàn)時(shí),，結(jié)果計(jì)算一定要求平均值。

標(biāo)本溶血可能會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該將加過(guò)樣品的板條放于密閉盒內(nèi),，并保持濕度約60%左右,。

為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準(zhǔn),。以確保實(shí)驗(yàn)溫度保持恒定,。

48T的試劑盒，所有組分均為96T的50%的量,。

[檢測(cè)前準(zhǔn)備工作]：

1.請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫后方可進(jìn)行試驗(yàn)。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25),。未用完的放回,。

3.1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)品:加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.0ml至凍干1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10分鐘,，待其充分溶解后,，輕輕混勻(濃度為100nmol/ml)，之后在管身標(biāo)注①,，然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋,。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：100、50,、25,、12.5、6.25,、3.125,、1.56nmol/ml)。注意：務(wù)必要保證凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解和混勻,。

4.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：取7支潔凈的試劑管,，分別標(biāo)注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.每管加入300μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300μl加入到第②管,，混勻后，再?gòu)牡冖诠苋〕?00μl加入到第③管，以此類(lèi)推至第⑦管,。第⑧管為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為陰性對(duì)照使用,。

注：復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液（100nmol/ml）請(qǐng)廢棄,，不可重復(fù)使用。

5.生物素化1,5-AG抗體工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需用量,，用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100),，配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準(zhǔn)備,。僅供當(dāng)日使用,。

6.酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1:100),，配置成酶結(jié)合物工作液,。使用前30分鐘準(zhǔn)備。僅供當(dāng)日使用,。

7.TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘,，按TMB顯色液A 9份加TMB顯色液B 1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。

[洗滌方法]：

1．自動(dòng)洗板機(jī)：要求注入的洗滌液為350μl,，注入與吸出間隔20－30秒,。確保機(jī)器運(yùn)用熟練后，再投入實(shí)驗(yàn)中使用,。

2．手工洗板：每孔加洗滌液350μl,，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,。手工洗板時(shí),，注意加入洗液的過(guò)程中，不要造成孔間污染,，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象,。

[操作步驟]：

從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃,。

預(yù)留空白孔（若使用雙波長(zhǎng)讀板,，空白孔可以不設(shè)）。

分別將標(biāo)本或不同濃度1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)品（0pg/ml孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）加入相應(yīng)孔中(100μl/孔),，37℃孵箱孵育90分鐘,。

提前30分鐘制備生物素化1,5-AG抗體工作液,。

洗板2次。

加入生物素化1,5-AG抗體工作液(100μl/孔),。37℃孵箱孵育60分鐘,。

提前30分鐘制備酶結(jié)合物工作液。室溫避光放置,。

洗板3次,。

除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔),。37℃孵箱,，避光孵育30分鐘。

洗板5次,。

加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱,，避光孵育,，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時(shí)候,，即可終止,。試驗(yàn)顯色反應(yīng)請(qǐng)勿超過(guò)30分鐘。

加入終止液（包括空白孔）100μl/孔,，混勻后即刻測(cè)量OD（450nm）值(10分鐘內(nèi)),。

[操作程序總結(jié)]：

[結(jié)果判斷]：

1．每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。（若不減零孔值,，標(biāo)準(zhǔn)曲線的零孔應(yīng)相交于Y軸）

2．手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo),，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn),。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。推薦使用專(zhuān)業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如curve expert 1.3進(jìn)行結(jié)果計(jì)算,。

3．若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè),，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù),。

[參考曲線]：

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算標(biāo)本含量,。

試劑盒參數(shù)：

[檢測(cè)范圍]：1.56-100nmol/ml

[靈敏度]：最小可測(cè)1,5-AG達(dá)0.938nmol/ml

[特異性]：系統(tǒng)和其它因子無(wú)交叉反應(yīng),。

[批間差]：≤12%.

[批內(nèi)差]：≤8%.

[回收率]：70-110%.

[保存]：-20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]

[用途]：用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）。

[規(guī)格]：96T/48T

[生產(chǎn)日期]：見(jiàn)酶標(biāo)板鋁箔袋封口鋼印,。

[保質(zhì)期]：12個(gè)月（-20℃）

[ELISA常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案]:

特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!以實(shí)際收貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),網(wǎng)站說(shuō)明書(shū)僅供參考！