液相色譜儀的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),,樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相,,被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),,在兩相中作相對運動時,,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,,液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng),、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng),、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),。 液相色譜儀柱效項與色譜過程動力學(xué)特性有關(guān),后兩項與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān),。
從基本分離方??煽闯?,提高分離度有三種途徑:①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長,,但這樣會延長保留時間,、增加柱壓。液相色譜儀更好的方法是降低塔板高度,,提高柱效,。②增加選擇性。當α=1時,,R=0,,無論柱效有多高,組分也不可能分離,。一般可以采取以下措施來改變選擇性:a.改變流動相的組成及PH值;b.改變柱溫,;c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的zui容易方法,,可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn),。k2趨于0時,R也趨于0,;k2增大,R也增大,。但k2 不能太大,,否則不但分離時間延長,而且峰形變寬,,會影響分離度和檢測靈敏度,。一般k2 在1~10范圍內(nèi),,為2~5,,窄徑柱可更小些。
液相色譜儀分配系數(shù)與組分,、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān),,也與溫度,、壓力有關(guān),。在不同的色譜分離機制中,,K有不同的概念:吸附色譜法為吸附系數(shù),離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù)),,液相色譜儀凝膠色譜法為滲透參數(shù),。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。
在條件(流動相,、固定相、溫度和壓力等)一定,,樣品濃度很低時(Cs 、Cm很?。r,,K只取決于組分的性質(zhì),,而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件,,在這種條件下,,得到的色譜峰為正常峰,;在許多情況下,,隨著濃度的增大,K減少,,這時色譜峰為拖尾峰;而有時隨著溶質(zhì)濃度的增大,,K也增大,,這時色譜峰為前延峰,。因此,,只有盡可能較少進樣量,使組份在柱內(nèi)濃度降低,,K恒定時,,才能獲得正常峰,。
液相色譜儀在同一色譜條件下,,樣品中K值大的組份在固定相中滯留時間長,后流出色譜柱,;K值小的組份則滯留時間短,,先流出色譜柱,。混合物中各組份的分配系數(shù)相差越大,,越容易分離,,因此,,混合物中各組份的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提,。在HPLC中,,固定相確定后,,K主要受流動相的性質(zhì)影響,。液相色譜儀實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及PH值,,以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間,,達到分離的目的,。
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