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1. 前言

復(fù)方duo粘菌素B軟膏為硫酸duo粘菌素B、硫酸新霉素,、桿菌肽和鹽酸li多卡因組成的復(fù)方制劑,，用于預(yù)防皮膚割傷、擦傷,、燒燙傷,、手術(shù)傷口等皮膚創(chuàng)面的細(xì)菌感染及暫時(shí)緩解疼痛等不適癥狀。硫酸duo粘菌素B為多肽類抗生素,，通過干擾細(xì)菌膜通透性與核糖體功能而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,，對銅綠假單胞菌、大腸桿菌,、嗜血桿菌等有良好的抗菌作用,。硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素,，可阻礙細(xì)菌核糖體30S亞基相聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)合成，引起其遺傳密碼錯(cuò)讀而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,，抗菌譜較廣,。桿菌肽為多肽類抗生素，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽的合成而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,，主要對革蘭氏陽性菌尤其對常見的金黃色葡萄球菌和各種鏈球菌抗菌活性強(qiáng),，對革蘭氏陰性球菌和某些放線菌、螺旋體,、阿米巴原蟲也有一定的抑制作用,。鹽酸li多卡因?yàn)轷０奉惥植柯樽硭帲渥饔脵C(jī)制為阻止神經(jīng)脈沖的發(fā)生,、傳導(dǎo)與傳播,。

duo粘菌素B和桿菌肽作為多肽類抗生素，通常采用液相色譜紫外檢測器法或微生物法測定,。而硫酸新霉素的紫外吸收較弱,，一般采用通用型檢測器進(jìn)行分析。鹽酸li多卡因則采用另一種液相色譜紫外方法進(jìn)行檢測,。因此對于該復(fù)方制劑,，可能需要2~3種液相色譜檢測法來分析其主要成分，其質(zhì)控流程較為繁瑣和耗時(shí),。也有研究采用HPLC-ELSD法來分析上述4種主要物質(zhì),，但該方法易受到復(fù)雜基質(zhì)的影響，靈敏度和重復(fù)性往往不能滿足檢測需求,。

本應(yīng)用嘗試采用HPLC-CAD法對這4種主要成分同時(shí)進(jìn)行檢測分析,，考慮到這4種主要成分有的缺乏紫外生色團(tuán)，有的紫外吸收波長較低,，易受干擾,。但這4種主要成分通常不揮發(fā)，電霧式檢測器（CAD）非常適合作為主要的檢測手段,。與蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）或示差折光檢測器（RI）相比,，CAD可兼容梯度洗脫，具有更高的靈敏度,，可降低復(fù)雜基質(zhì)的干擾,。

duo粘菌素B結(jié)構(gòu)式：

硫酸新霉素結(jié)構(gòu)式：

桿菌肽結(jié)構(gòu)式：

鹽酸li多卡因結(jié)構(gòu)式：

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1

儀器

Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色譜儀，泵：Quaternary Pump C,，自動(dòng)進(jìn)樣器：Split Sampler CT,，柱溫箱：Column Compartment C，CAD檢測器：Vanquish CAD H。色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3

2.2

試劑

乙腈,、甲酸,、三氯yi酸（色譜級(jí)，F(xiàn)isher）,，去離子水（18.2 M?@25°C,，Millipore純水機(jī)）,。

2.3

儀器

硫酸duo粘菌素B,、硫酸新霉素、桿菌肽和鹽酸li多卡因

2.4

樣品

市售復(fù)方duo粘菌素B軟膏

2.5

色譜條件

色譜柱：Phenyl 4.6mm×250mm,，5 µm
柱溫：40°C
檢測器參數(shù)：蒸發(fā)溫度50℃,，采集頻率5Hz，F(xiàn)ilter 3.6s,，PFV 1.0
進(jìn)樣量：5µL
流動(dòng)相A：40mM三氯yi酸,，B：甲醇， C：乙腈
梯度洗脫：參見表1
流速：1.0 mL/min

表1：梯度洗脫程序

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專屬性和線性范圍

分別取硫酸duo粘菌素B,、硫酸新霉素,、桿菌肽和鹽酸li多卡因適量，用水溶解并稀釋得到一系列不同濃度的混標(biāo)溶液,，考察專屬性和線性情況,。各單標(biāo)溶液及空白溶劑疊加色譜圖如圖1所示，結(jié)果表明該方法條件下各物質(zhì)分離效果,、峰形及峰響應(yīng)均良好,，空白溶液無干擾。

圖1：4種單標(biāo)及空白（黑色）疊加色譜圖

混標(biāo)溶液的典型色譜圖如圖2所示,，取4~40ppm濃度范圍的混標(biāo)溶液分別進(jìn)樣,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2：混標(biāo)溶液典型色譜圖

圖3：各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果顯示,， 各物質(zhì)在其濃度范圍內(nèi)線性良好,，相關(guān)系數(shù)均≥ 0.997

表2：方法線性結(jié)果

3.2 靈敏度

將混標(biāo)溶液不斷稀釋并進(jìn)行檢測，通過信噪比（S/N）值來考察CAD檢測器對硫酸duo粘菌素B,、硫酸新霉素,、桿菌肽和鹽酸li多卡因的靈敏度。如圖4所示,，當(dāng)混標(biāo)濃度為8ppm時(shí),，各物質(zhì)的S/N接近定量限要求；當(dāng)混標(biāo)濃度為4ppm時(shí),，各物質(zhì)的S/N接近檢測限要求,結(jié)果表明HPLC-CAD方法靈敏度較高,。

圖4：各物質(zhì)的檢測限（LOQ）和定量限（LOD）

3.3 重復(fù)性

取濃度為20ppm的混標(biāo)溶液連續(xù)進(jìn)樣6針后計(jì)算各物質(zhì)峰面積的%RSD，來考察CAD檢測器的重復(fù)性,，結(jié)果見表3,、圖5,。

表3：各物質(zhì)重復(fù)性結(jié)果

圖5：重復(fù)性結(jié)果色譜圖

3.4 樣品分析

取市售復(fù)方duo粘菌素B軟膏樣品適量，加水混勻,，振蕩30分鐘后離心3分鐘,，取上清液過微孔濾膜后直接進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品中各物質(zhì)峰形,，靈敏度及分離度等均符合分析要求（圖6）,。

圖6：市售樣品色譜圖

4. 結(jié)論

本應(yīng)用建立一種HPLC-CAD法，可對復(fù)方duo粘菌素B軟膏中的硫酸duo粘菌素B,、硫酸新霉素,、桿菌肽和鹽酸li多卡因這4種主要成分同時(shí)進(jìn)行檢測分析。該方法靈敏度較高,，檢測限可低至4µg/mL,；重復(fù)性好，連續(xù)6針峰面積%RSD均＜2.5%,；基質(zhì)干擾小,，市售產(chǎn)品中的各物質(zhì)峰基本不受基質(zhì)影響。本應(yīng)用方法方便,、快捷,，可有效提高檢測效率，縮短產(chǎn)品質(zhì)控流程,。