2022/09 —— 賽默飛擴(kuò)展您的科研視野
十年磨一劍,，創(chuàng)新yong不停,。值此金秋丹桂飄香之際，賽默飛重磅推出了三合一質(zhì)譜系列的巨作——Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend 三合一質(zhì)譜系統(tǒng),。這是繼Orbitrap Eclipse 三合一質(zhì)譜之后的再一力作,，也是近10年來三合一質(zhì)譜最大的革新。
Orbitrap Ascend質(zhì)譜在提升整體性能和使用簡便性的同時,，旨在解決生命科學(xué)研究中的挑戰(zhàn),，在蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定、定量蛋白質(zhì)組學(xué),、結(jié)構(gòu)生物學(xué),、生物制藥分析、以及小分子復(fù)雜性樣品研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力,。本期小編將帶領(lǐng)大家來一段Orbitrap Ascend質(zhì)譜應(yīng)用之旅,，以期借助我們的介紹，以小致大,，讓賽默飛伴行您的科研之路,，助力您拓展研究視野。
Orbitrap Ascend
全新升級
在質(zhì)譜領(lǐng)域的漫漫長河里,，新的技術(shù)嘗試層出不窮,，各式各樣的質(zhì)譜產(chǎn)品也曾豐富著這個市場。截至目前為止,，在經(jīng)典,、耐用的質(zhì)譜主要為四極桿、離子阱,、基于傅里葉變換的FT和Orbitrap,，以及飛行時間質(zhì)譜，這幾類產(chǎn)品及其組合組成了目前市場上主要的質(zhì)譜產(chǎn)品,。2013年,，基于四極桿、離子阱和Orbitrap質(zhì)量分析器的三合一質(zhì)譜橫空出世,，集超高的分辨率,、靈敏度、穩(wěn)定性及各項擴(kuò)展功能于一體,，一經(jīng)推出即獲得了廣泛的關(guān)注,，極大地驅(qū)動了生命科學(xué)等領(lǐng)域的認(rèn)知和應(yīng)用,。
△圖1：Orbitrap Ascend 三合一質(zhì)譜儀
如今離第一款發(fā)布的三合一質(zhì)譜Fusion的發(fā)布已近10年，最新型的三合一質(zhì)譜儀Orbitrap Ascend質(zhì)譜的革新成為了近10年來,，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化最大的一次,。
簡而言之，
Orbitrap Ascend主要的革新在于4個層面：
（1）采用更溫和的離子漏斗技術(shù),，減少易碎裂物質(zhì)的源內(nèi)裂解水平,，提高檢測限，減少假陽性,；
（2）C-Trap 前全新增加多級離子通道,，用于常規(guī)離子儲存和MS2碎裂，提升靈敏度和掃描速度,；后面的多級離子通道依然用于CID,、 ETD, UVPD, PTCR and MSn HCD ，保持了系統(tǒng)的多功能性,；
（3）采用全新傳輸模塊,，提高高質(zhì)量端離子傳輸效率，離子的掃描范圍擴(kuò)大至m/z 16000（選配HMR?+模式）;
（4）全新的自動校正離子源,，自定義校正的時間和周期,，儀器自動進(jìn)行校正，從而維持系統(tǒng)在最佳性能狀態(tài),；
形成了我們今天所看到的Orbitrap Ascend 三合一系統(tǒng),。
△圖2 Orbitrap Ascend三合一質(zhì)譜內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖
（點擊查看大圖）
02
Orbitrap Ascend
應(yīng)用領(lǐng)域的更新
Orbitrap Ascend 核心模塊的革新，帶來的是功能上的升級,，以應(yīng)對蛋白質(zhì)組學(xué)對靈敏度和通量、生物制藥,、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及小分子應(yīng)用中不斷出現(xiàn)的挑戰(zhàn),，從而擴(kuò)展研究的深度和范圍。
△圖3 Orbitrap Ascend三合一質(zhì)譜應(yīng)對
生命科學(xué)研究中的挑戰(zhàn)（點擊查看大圖）
2.1 常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定
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蛋白質(zhì)組學(xué)一直是后基因組學(xué)時代重要的研究領(lǐng)域之一,，如何提高蛋白質(zhì)的覆蓋度,，提升鑒定深度和廣度，一直是科學(xué)家們研究的方向之一,。Orbitrap Ascend 質(zhì)譜采用前置的IRM 提高了離子傳輸效率,，靈敏度和掃描速度。
我們采用1 ug HeLa, 50 cm 色譜柱上樣,，30分鐘和45分鐘分別可以鑒定到6137和6621個蛋白,；46992和56175條肽段。蛋白和肽段的鑒定數(shù)量在相同時間下增加了15%和34%,。有效的提升了分析的通量,，降低實驗成本,。
△圖4 Orbitrap Ascend有效提升蛋白和肽段
鑒定數(shù)目（點擊查看大圖）
2.2 翻譯后修飾
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然而，細(xì)胞的許多生命過程不僅與蛋白質(zhì)的相對豐度相關(guān),，還受時空分布可逆的翻譯后修飾控制,。因翻譯后修飾的蛋白的豐度往往較低，且并非很穩(wěn)定,，因此對儀器的性能提出了更高的要求,。
Wisconsin-Madison學(xué)校的Josh Coon 實驗室針對蛋白質(zhì)磷酸化的研究顯示，Orbitrap Ascend 質(zhì)譜可檢測到12050條磷酸化肽段,，8821個磷酸化位點,。相比于前一代的產(chǎn)品，有18~25% 的提升,。Coon 博士也對Ascend 系統(tǒng)的性能有著很高的評價,，通過擴(kuò)大磷酸化肽段的覆蓋度，提升信號通路深度挖掘或藥物活性細(xì)胞機(jī)制的檢測能力,。
△圖5 Orbitrap Ascend有效提升PTM 磷酸化肽段
和位點數(shù)目（點擊查看大圖）
2.3 定量蛋白質(zhì)組學(xué)—TMT定量
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TMT標(biāo)記定量采用混樣一次上機(jī)多個樣本進(jìn)行分析,，可以大大的提升分析的通量。目前已推出了TMTpr 18-plex,，一次性可以分析18個樣品,。相對于常規(guī)LFQ 定量來說，TMT定量不單提高了分析的通量,，同時具有更少的缺失值,，數(shù)據(jù)記錄更為完整。
哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Steven Gygi 團(tuán)隊采用4個細(xì)胞系,，12個高pH餾分分級,，結(jié)合SPS MS³及實時搜索功能，定量了83386條肽段,， 8788的蛋白,。Gygi 博士表示，500個蛋白鑒定數(shù)量的差異,，對于65分鐘梯度來說非常顯著,，提升了定量蛋白研究的深度。
依賴于Ascend 系統(tǒng)更快的掃描速度及靈敏度,，以及實時檢索,，可顯著提高低上樣量樣品肽段和蛋白的鑒定數(shù)量（酵母酶解肽段，圖7）,，并進(jìn)一步提高SPS-MS³的定量準(zhǔn)確性,。
△圖7 Orbitrap Ascend顯著提高TMT定量肽段
數(shù)目和通量（點擊查看大圖）
2.4 結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物藥分析
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Ascend 質(zhì)譜采用了新型離子傳輸模塊，有效的提高高質(zhì)量端離子傳輸效率,，離子的質(zhì)量范圍擴(kuò)展至m/z 16000（選配的HMR?+模式）,。在蛋白高級結(jié)構(gòu)解析及蛋白質(zhì)與小分子共價結(jié)合分析領(lǐng)域中,，更高的質(zhì)量范圍可以有效提高蛋白質(zhì)的檢測范圍。
采用選配的HMR?+結(jié)合多種碎裂方式,，針對細(xì)菌中分子量約800 kDa的伴侶蛋白家族的蛋白質(zhì)GroEL進(jìn)行分析,，在m/z 12,000左右可以清晰的表征。
△圖8 細(xì)菌中伴侶蛋白家族的蛋白質(zhì)
GroEL分析（點擊查看大圖）
在完整蛋白分析中,，提升檢測的質(zhì)量范圍只能解決一部分問題,。如何降低譜圖的復(fù)雜性，提供更多可供解析的譜圖是另一個核心點,。當(dāng)?shù)鞍追肿釉酱?，帶電荷?shù)就越復(fù)雜，很難解析出明確的帶電荷數(shù)目,。另外,，由于共流出的存在，往往存在譜圖非常復(fù)雜,，造成可供解析的譜圖較少,。
選配的質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少技術(shù)（PTCR）通過將蛋白質(zhì)帶有的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給全氟 (十四氫菲)離子，從而造成蛋白質(zhì)本身電荷逐漸減少,，形成一系列電荷減少的離子,，再通過相鄰價態(tài)離子間的質(zhì)荷比間距即可計算出蛋白質(zhì)的電荷數(shù)目。在對細(xì)胞因子-Fc 融合蛋白進(jìn)行分析時,，采用PTCR技術(shù)與HMR?+ 的組合,，簡化的譜圖將有助于去卷積。在m/z 5900~6050 這2個PTCR譜圖中,，可以鑒定10 種完整糖型,，從而從復(fù)雜混合物中解析到更多的蛋白質(zhì)。
△圖9 PTCR技術(shù)去唾液酸化的Cytokine-FC
蛋白分析（點擊查看大圖）
2.5 全自動校正離子源
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在大隊列分析中,，需要保持儀器一直處于最佳狀態(tài),，Ascend 系統(tǒng)在易用性上也做了極大的改進(jìn)?？梢愿悄芑摹⒆詣踊膩韺x器進(jìn)行校正,。我們只需要設(shè)定個校正周期,，選擇好時間；軟件會自動開始運(yùn)行校正的項目,。從而節(jié)省出時間,，并且一直維持儀器在一個良好的狀態(tài)。一般推薦每周校正一次即可,。
質(zhì)譜技術(shù)極大地驅(qū)動了生命科學(xué),、制藥以及食品環(huán)境領(lǐng)域的長足進(jìn)步,。這次發(fā)布的Ascend 系統(tǒng)，無論是在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué),；定量蛋白質(zhì)組學(xué),；PTM 分析；完整蛋白質(zhì)表征,、生物制藥分析,；還是偏向于小分子的代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué),、代謝流等領(lǐng)域,；Orbitrap Ascend質(zhì)譜都可以提供強(qiáng)大靈活的功能相匹配，提升科學(xué)家們研究的深度和廣度,。
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