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道一聲珍重,，道一聲珍重，那一聲珍重里有蜜甜的憂愁,，在這里,，我們?yōu)槭裁唇o了這個(gè)美麗的句子呢？因?yàn)槲覀冞@一期的主題是,，蛋白質(zhì)修飾中的一個(gè)很"甜蜜"的組學(xué)技術(shù),，也是蛋白質(zhì)組學(xué)人"蜜甜的煩惱"，那就是糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué),。

我們知道,，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)表征中的重要部分，因其極大的增加了蛋白質(zhì)水平的復(fù)雜度,，并且能夠提供超越基因水平的注釋信息,。其中，糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重點(diǎn),、難點(diǎn)之一,。與遵守中心法則的轉(zhuǎn)錄和翻譯不同的是，糖基化中糖鏈的合成沒(méi)有模板,，是多酶聯(lián)合作用的結(jié)果,，難以通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組或者蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè),，除了位點(diǎn)水平的宏觀不均一性外,，同一個(gè)糖基化位點(diǎn)上可能存在多種糖型,，稱之為微觀不均一性。因此,，這也使得糖肽,、糖鏈的豐度進(jìn)一步被分割降低，檢測(cè)的難度進(jìn)一步增加,。

鑒于在糖肽的鑒定與定量研究中遇到的諸多困難,，復(fù)旦大學(xué)陸豪杰教授團(tuán)隊(duì)近日在《國(guó)家科學(xué)評(píng)論》（National Science Review, NSR）發(fā)表題目為High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis的文章^[1]，意在通過(guò)DMEN化學(xué)標(biāo)記法與賽默飛HCD-pd-ETD的質(zhì)譜采集技術(shù),，對(duì)人血清樣品中的完整糖肽進(jìn)行高通量的定性與定量分析,，并可通過(guò)糖標(biāo)志物組合對(duì)不同肝臟疾病病程進(jìn)行區(qū)分。

研究詳情

DMEN標(biāo)記法,，即基于N,N-dimethylethylenediamine(DMEN)標(biāo)記的方法,，可參照作者團(tuán)隊(duì)于2019年發(fā)表的Chemical Science的文章^[2]。

圖1：DMEN與糖肽的羧基端的反應(yīng)

基于質(zhì)譜表征的完整糖肽其痛點(diǎn)在于,，復(fù)雜樣品中糖肽的含量較低且存在微觀不均一性,，糖肽親水，帶電困難,，且由于糖鏈和肽鏈的同時(shí)存在,，碎裂能量多被糖苷鍵吸收等困難。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,，ETD技術(shù)因能夠產(chǎn)生較好的鑒定糖肽肽段部分的碎片離子信息,，逐漸成為鑒定糖肽的重要手段之一。為了更好的提升ETD的碎裂效率,，本篇文章作者團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的DMEN標(biāo)記的方法有效提升多肽的帶電,，提升的電荷數(shù)有利于下一步質(zhì)譜中ETD的碎裂，得到更加豐富的c,、z離子,。本篇文章中，糖肽的質(zhì)譜鑒定所用到的ETD碎裂模式,，特指的是賽默飛三合一系列質(zhì)譜儀所*的HCD-pd-ETD的模式,。研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用DMEN+TMT標(biāo)記+HCD-pd-ETD的方法，對(duì)收集的包括23例健康對(duì)照組,、24例HBV感染組,、22例CIR組和21例HCC組的共90例患者的血清樣品，使用前述的HTiGQs方法進(jìn)行完整糖肽分析,。實(shí)驗(yàn)共鑒定到313條來(lái)自于IgG的完整N糖肽,，這個(gè)數(shù)據(jù)是迄今報(bào)道的最大的人血清IgG亞類特異性和位點(diǎn)特異性的N糖肽數(shù)據(jù)集。糖肽的電荷數(shù)的增加，使得糖肽鑒定的譜圖中,，鑒定到的糖肽的ETD譜圖高于HCD譜圖,，而在ETD中鑒定到的譜圖98%的譜圖都同時(shí)有ETD譜圖。

圖2：高通量完整糖肽定量策略

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圖3：HCD-pd-ETD質(zhì)譜采集技術(shù)

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在擁有了高質(zhì)量的鑒定信息后,，在定量研究策略中,，作者在workflow的第一步使用了基于賽默飛TMT-10plex的標(biāo)記策略，以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽高準(zhǔn)確度的定量,；TMT (Tandem mass tag)技術(shù)是賽默飛研發(fā)的多肽體外等重同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù),，最高通量為18-plex，質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)可實(shí)現(xiàn)來(lái)源于不同的生物學(xué)樣品的的同一條多肽可實(shí)現(xiàn)色譜共洗脫,，一級(jí)譜共隔離,，并能在同一張二級(jí)譜上同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性與定量。

圖4：TMT定量策略

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與非糖肽相比,，糖肽的報(bào)告離子的強(qiáng)度偏低,，這顯然不利于定量。有研究報(bào)道使用stepped NCE的方法,，以20-30-40%的能量進(jìn)行碎裂,，可以在同一張譜圖中同時(shí)得到大量的糖鏈和肽鏈所產(chǎn)生的碎片離子信息,。而我們知道,，TMT需要更高的碰撞能量，這些能量可以大部分被糖苷鍵所吸收,，報(bào)告離子強(qiáng)度低則會(huì)直接影響定量的準(zhǔn)確性,、重現(xiàn)性及靈敏度?；诖?，作者探索了sceHCD-ETD, sceHCD-pd-ETD, and HCD-ETD不同能量的組合，從結(jié)果可以看出,，HCD-pd-ETD的方法要優(yōu)于僅適用ETD碎裂,，sceHCD-pd-ETD NCE 50 ± 10 的方法所鑒定到的糖肽數(shù)量最多，且碰撞能量的提高也可以提高TMT報(bào)告離子的強(qiáng)度,，有利于定量,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，利用不同混樣比例對(duì)TMT定量的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn),，實(shí)測(cè)ratio值與理論ratio值接近,；N糖肽的TMT定量的高度的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性，這使得在更復(fù)雜的大規(guī)模樣品中實(shí)現(xiàn)對(duì)N糖肽的定性定量成為可能,。

圖5：TMT定量準(zhǔn)確性

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為了進(jìn)一步篩選出可以對(duì)疾病病程進(jìn)行分類的糖肽,，研究團(tuán)隊(duì)從來(lái)源于不同肝臟疾病樣品的差異表達(dá)的糖肽的27個(gè)候選的糖肽中進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)， IgG1-H3N5F1 和IgG4-H4N3 可作為分辨肝病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程潛在的生物標(biāo)志物。最后,，作者還選取了7個(gè)在大多數(shù)臨床樣品中發(fā)現(xiàn)且具有代表性的差異表達(dá)的糖肽在驗(yàn)證集（包含11例健康對(duì)照,、12例HBV感染樣品、11例CIR組和11例HCC樣品）中進(jìn)行了PRM方法的驗(yàn)證,。

圖6：肝臟疾病病程診斷的潛在的糖標(biāo)志物的篩選（點(diǎn)擊查看大圖）

另,，為驗(yàn)證方法適用性，作者團(tuán)隊(duì)還將HTiGQs方法應(yīng)用于人血清糖蛋白質(zhì)組學(xué),。每位受試者取10μl血清樣品,，共鑒定了包含1961個(gè)unique N糖肽的168個(gè)糖蛋白。經(jīng)DMEN標(biāo)記后,，可鑒定到更多的且電荷數(shù)更多,、分子量更大的糖肽；而在聚糖類型方面,，不同的模式具有不同的碎裂傾向,，可對(duì)糖肽進(jìn)行互補(bǔ)性的采集。

圖7：人血清中N-糖肽的鑒定

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肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟,、長(zhǎng)期,、復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。曾經(jīng)的中國(guó)是乙肝大國(guó),，也是HCC高發(fā)區(qū),；目前，通過(guò)疫苗的普及及疾病的研究,，2020年,，中國(guó)也逐步實(shí)現(xiàn)了乙肝大國(guó)的“摘帽"。需要看到的是,，目前乙肝仍然是中國(guó)面臨的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,，我國(guó)的乙肝患者的絕對(duì)數(shù)量仍然很高，故關(guān)注乙肝感染引發(fā)的病程發(fā)展,，減緩肝細(xì)胞癌的發(fā)生,，改善患者的生存質(zhì)量仍是我國(guó)廣大的醫(yī)藥工作者、科學(xué)家們的不懈追求,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sun, Zhenyu, et al. "High-throughput site-specific N-glycoproteomics reveals glyco-signatures for liver disease diagnosis." National Science Review (2022).

[2] Yang, Lijun, et al. "Chemical labeling for fine mapping of IgG N-glycosylation by ETD-MS." Chemical science 10.40 (2019): 9302-9307.

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