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　　近年來(lái)，隨著人們對(duì)醫(yī)療健康行業(yè)需求的不斷增長(zhǎng),，生物制藥行業(yè)也在隨之蓬勃發(fā)展,。近兩年的疫情全球大流行，在改變?nèi)藗內(nèi)粘Ｉ畹耐瑫r(shí)更是催生了生物制藥行業(yè)對(duì)于先進(jìn)分析技術(shù)的需求,。
 

　　蛋白質(zhì)分離,、純化和分析是生物zhi療藥物開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵組成部分，但該過(guò)程可能復(fù)雜且具挑戰(zhàn)性,。而全柱成像等電毛細(xì)管電泳(whole column imaged capillary isoelectric focusing, WC-iCIEF)技術(shù),，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)差異將其分離，在此基礎(chǔ)上,，將iCIEF與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用,，可以借助質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨率和高質(zhì)量精度使各種蛋白質(zhì)變異體的鑒定更容易,、更準(zhǔn)確,。從2021年6月開(kāi)始，我們與蛋白質(zhì)成像技術(shù)專家 Advanced Electrophoresis Solutions Ltd (AES)宣布達(dá)成協(xié)議,，將蛋白質(zhì)分離技術(shù)與質(zhì)譜相結(jié)合,，通過(guò)簡(jiǎn)化表征來(lái)推進(jìn)zhi療性蛋白質(zhì)藥物的開(kāi)發(fā),。
 

　　到目前為止，通過(guò)將iCIEF技術(shù)與高分辨質(zhì)譜聯(lián)合使用,，我們已經(jīng)對(duì)單抗、ADC和融合蛋白等多種產(chǎn)品進(jìn)行了各種層面的表征,。下圖1~3展示了iCIEF技術(shù)對(duì)單抗\ADC\融合蛋白的分離結(jié)果,，可見(jiàn)對(duì)于不同種類的重組生物zhi療性產(chǎn)品，均可根據(jù)pI差異將其電荷變異體進(jìn)行分離,，且系統(tǒng)具有優(yōu)異的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性,。
 

圖1 iCIEF-UV分析帕博利珠單抗電荷變異體，8針平行進(jìn)樣(點(diǎn)擊查看大圖)
 

圖2 iCIEF-UV分析恩美曲妥珠電荷變異體,，3針平行進(jìn)樣
 

　　我們使用的CEInfinite iCIEF平臺(tái)(AES)除了高質(zhì)量的iCIEF-UV功能外，還可以與高分辨質(zhì)譜直接在線串聯(lián),，直接測(cè)定電荷變異體的分子量,，無(wú)需額外轉(zhuǎn)換接口。下圖4展示了我們使用iCIEF-MS直連技術(shù)分析帕博利珠單抗的結(jié)果,，可見(jiàn)即使是pI僅差0.02的堿峰B1和主峰,，也可以在iCIEF上得到基線分離，隨后的高分辨質(zhì)譜分子量測(cè)定結(jié)果顯示該堿峰與主峰相比,，主要差異是其中一條重鏈的N端未發(fā)生焦谷氨酸環(huán)化,。另外觀察原始質(zhì)譜譜圖不難發(fā)現(xiàn)，得益于Orbitrap高分辨質(zhì)譜的靈敏度,，即使是強(qiáng)度比主峰低2~3個(gè)數(shù)量級(jí)的堿峰B3,，仍可得到糖型分布清晰的譜圖。
 

　　圖4 iCIEF-MS在線直聯(lián)分析帕博利珠電荷變異體,。上,，iCIEF-UV分離圖譜。中,，堿峰B1與主峰解卷積結(jié)果鏡像圖對(duì)此,。下，主峰與所有堿峰原始質(zhì)譜圖對(duì)比,。(點(diǎn)擊查看大圖)
 

　　與市面上其他供應(yīng)商相比,，AES的CEInfinite iCIEF平臺(tái)具有一個(gè)*優(yōu)勢(shì)：可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)的餾分收集。我們選擇了帕博利珠單抗,，對(duì)其電荷變異體的每個(gè)峰離線收集后進(jìn)行酶解,，隨后上樣至高分辨液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)進(jìn)行肽圖分析。圖5展示了酸/堿峰中各種CQA含量的變化,，可見(jiàn)輕重鏈末端,、重鏈糖型和側(cè)鏈常見(jiàn)PTM的變化趨勢(shì),。另外通過(guò)表1中分離之前/之后特定CQA含量對(duì)比可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)iCIEF分離后,，酸/堿峰中特定修飾的比率有明顯zhen高,，可見(jiàn)基于pI差異，將生物zhi療性產(chǎn)品的電荷變異體進(jìn)行分離后,，接下來(lái)采用肽圖進(jìn)行深入表征的分析策略,，能夠幫助研究人員將導(dǎo)致電荷異質(zhì)性的修飾精確定位到氨基酸位點(diǎn)的層面。