大家先看幾個耳熟能詳?shù)臄?shù)據(jù)：
每年有約400萬中國人死于吸煙引發(fā)疾病,，超過因艾滋病、結(jié)核,、交通事故及死亡的人數(shù)總和,；
平均每6秒就有一個人死于吸煙有關疾病,；
吸煙者的平均壽命要比不吸煙者縮短10年,；
*每年因吸煙死亡人數(shù)高達700萬，其中89萬為常年吸食二手煙導致,。
1究竟是什么讓吸煙如此有害健康,？
吸煙者多死于肺癌，煙氣中常見的有害物苯并芘是一種高活性間接致癌物,，屬于多環(huán)芳烴的一種,。多環(huán)芳烴（簡稱PAHs）是人類早發(fā)現(xiàn)的一類環(huán)境有機致癌化合物，廣泛存在于煙熏燒烤類食品,、香煙煙霧中,，通過呼吸道,、消化道和皮膚進入人體，參與體內(nèi)代謝,，生成羥基多環(huán)芳烴（OH-PAHs）,。香煙煙霧作為多環(huán)芳烴的一個重要來源，是吸煙者（包括吸二手煙者）接觸多環(huán)芳烴的主要途徑,。
圖1 非吸煙者（左）與吸煙者（右）肺部對比圖
2如何檢測人體內(nèi)的多環(huán)芳烴（PAHs）,？
目前，尿液中的OH-PAHs是研究多的人體對PAHs 的暴露水平綜合評價的生物標志物,。但是尿液中多環(huán)芳烴代謝物的含量極低,，且尿液成分較復雜，所含雜質(zhì)可能對色譜柱造成損害,，直接進樣不能滿足分析要求,。而現(xiàn)有采用離線固相萃取技術(shù)來減少基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度的方法,，操作過程繁瑣費時,，重現(xiàn)性較差，成本較高,。
在線固相萃?。∣nline-SPE）是近年發(fā)展起來的一種全自動樣品前處理方式，具有富集純化一步完成,、固相萃取柱可多次使用,、重現(xiàn)性好、自動化程度高等優(yōu)點,，已被應用于食品,、環(huán)境、生物等樣品中痕量有機物的檢測,。
賽默飛與“國家生物監(jiān)測”重點實驗室之一的上海疾病預防控制中心合作,，開發(fā)了基于賽默飛雙三元液相色譜—在線SPE大體積進樣方法，實現(xiàn)人體尿液中多環(huán)芳烴羥基代謝產(chǎn)物的高靈敏度監(jiān)測,。
“國家人體生物監(jiān)測項目”是國家衛(wèi)生計生委疾控局組織的國家重大公共衛(wèi)生服務項目,，通過在全國開展現(xiàn)場流行病學調(diào)查和人體生物樣本中環(huán)境化合物檢測，獲得全國有代表性的環(huán)境化合物在人體內(nèi)暴露負荷的基礎數(shù)據(jù),，為今后相關公共衛(wèi)生工作提供技術(shù)支持,。
本方法采用基于快速渦流色譜的Turboflow Cyclone 固相萃取柱對目標尿樣進行在線富集純化，將大分子蛋白雜質(zhì)提前分離去除,，不僅延長了固相萃取柱使用壽命,，而且進一步降低了交叉污染率。同時,，采用UHPLC-MS法,，利用PAHs 細粒徑UHPLC色譜柱對多環(huán)芳烴代謝物實現(xiàn)快速分離,，解決了常規(guī)液相分離中部分目標物的出峰無法*分開和無法準確定性定量的問題，結(jié)合大體積進樣,，大大提高了檢測靈敏度,。
圖2 在線SPE大體積進樣系統(tǒng)工作原理圖
【進樣富集】
【轉(zhuǎn)移】
【分析過程】
實驗條件
富集柱：Turboflow Cyclone柱（50×0.5 mm）,；
分析柱：PAH UHPLC柱（2.1x100 mm,，1.8 μm）；
柱溫30℃,；進樣量2500 μL,；
流動相A：水，B：甲醇:乙腈（1:1）,；
梯度洗脫程序表1,；質(zhì)譜條件：負離子電噴霧（ESI-）。
表1 梯度洗脫程序
表2 多環(huán)芳烴羥基代謝物的保留時間,、檢測離子對和碰撞電壓
注：帶“*”為定量離子對,。
檢測結(jié)果
通過使用Turboflow Cyclone富集柱和1.8 μm UHPLC細徑分析柱（2.1x100 mm），12種目標化合物能夠在短時間內(nèi)快速分離,，混合標準溶液的總離子流圖見圖3,。標準物質(zhì)的實驗結(jié)果顯示方法線性范圍廣（0.002~1.0 μg/L），線性較好,，且回收率高（90%~110%）,，各目標物在尿液中的檢出限低可達到0.001 μg/L水平，各目標物的6次進樣結(jié)果RSD不超過5%,，重復性較好,。實驗采集了24個尿液樣本（9名兒童和15名成人，包括6名吸煙成人男性）進行分析,，檢測結(jié)果顯示,，吸煙者尿液中各種多環(huán)芳烴代謝物檢出量顯著高于非吸煙者（見表2）。
圖3 各多環(huán)芳烴羥基代謝物標準溶液的總離子流圖
表3 吸煙和非吸煙者尿液樣品中部分多環(huán)芳烴羥基代謝物測定結(jié)果
結(jié)論
本方法采用雙三元在線固相萃取前處理方法,，大大簡化了樣品前處理過程,，分析成本大為降低，樣品經(jīng)固相萃取柱富集濃縮后在線轉(zhuǎn)移至分析柱進行分析,，樣品中的待測組分能全部轉(zhuǎn)移至分析柱,，樣品用量少且無損耗，采用質(zhì)譜檢測器可獲得較高的靈敏度,，可實現(xiàn)大批量樣品的自動,、快速、檢測,。
感謝上海疾病預防控制中心各位老師的辛勤工作,，老師們用實驗數(shù)據(jù)再一次告訴我們：為健康,，為家人，為自己,，請拒絕吸煙,！
關鍵詞：雙三元液相色譜；在線固相萃??；多環(huán)芳烴羥基代謝物；LC-MS
注：以上數(shù)據(jù)由上海疾病預防控制中心化學品毒性檢定所提供
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