果糖 1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FDA）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

植物葉綠體中果糖 1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與calvin 循環(huán)的重要酶,。催化果糖 1,6-二磷酸和景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反應(yīng),，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng),。

測定原理：

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和 α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化 NADH 和磷酸二羥丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油,，340nm 處吸光值的變化可反映果糖 1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低,。

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒   光合系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存,。臨用前加 2ml 蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加 2 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存,。臨用前加 2 ml 蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑五：液體 2ml×1 瓶,，4℃避光保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

天平,、震蕩儀、低溫離心機(jī),、研缽,、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板,。

酶液提?。?/span>

①總FDA 酶提取NADPH 的提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎 3s,，間歇 7s，總時間 1min）,，然后 4℃，8000g 離心 10min,，取上清測定,。

②胞漿和葉綠體FDA 酶的分離：NADP⁺的提取：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10

的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一）,，冰浴勻漿后于 4℃,，200g 離心 5min，棄沉淀,，取上清在 4℃，8000g 離心 10min,，取上清用于測定胞漿FDA 酶活性,，取沉淀加 1ml 提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎 3s,，間歇 7s,，總時間 1min），然后 4℃,，8000g 離心 10min,，取上清測定葉綠體中FDA 酶活性。

建議測定總FDA 酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 FDA，則按照步驟

②提取粗酶液,。

測定操作：

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 取微量石英比色皿/96 孔板,，依次加入 100μL 試劑一，20μL 試劑二,，20μL 試劑三,，20μL 試劑四，20μL試劑五,，20μL 粗酶液,，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值A1 和 310s 的吸光值A2,，△A=A1-A2

計算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

= 321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/ml）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積,，1ml,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

= 643.08×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/ml）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 643.08×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，0.5cm,； V 樣：加入樣本體積，0.02ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1ml；T：反應(yīng)時間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒   光合系列