輔酶ⅡNADP(H)含量測定試劑盒(分光光度法）

分光光度法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,，與糖異生途徑,、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機體糖,、脂,、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

測定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸,。GAPDH 逆向催化 1,3 二磷酸甘油酸和NADH 生成 3 磷酸甘油醛,、無機磷和 NAD，340nm 處測定NADH 的減少量可反映GADPH 活性的高低,。

輔酶ⅡNADP(H)含量測定試劑盒   光合系列

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀,、恒溫水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

組織樣本的前處理:

①總GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本,，加入 1ml 提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴,，200W,，破碎 3s，間歇 7s,，總時間 1min）,，然后 4℃,，8000g 離心 10min，取上清測定,。

②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本,，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃,，200g 離心 5min,，棄沉淀，取上清在 4℃,， 8000g 離心 10min,，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎 3s,，間歇 7s,，總時間 1min），然后 4℃,，8000g 離心 10min,，取上清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。

建議測定總GAPDH 酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的 GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液,。

細菌或培養(yǎng)細胞的前處理：

先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

測定步驟

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1） 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中,，充分溶解，37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 10 分鐘,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

（2） 在試劑三中加入 500μl 蒸餾水,，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μl 樣本,、5μl 試劑三和 190μl 工作液，混勻,，加入最后一個試劑的同時開始計時,，記錄 340nm 處 20s 時的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2,。

GAPDH 活性計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.005 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=5.144×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96 孔板光徑，0.5cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.005 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。

輔酶ⅡNADP(H)含量測定試劑盒   光合系列