肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類?；D(zhuǎn)移酶,。可逆地催化從?；鵩u酶 A 將?；D(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應，在轉(zhuǎn)運脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用,。

測定原理：

基于肉堿和脂酰fu酶A 在丙二酰fu酶A 存在與否的條件下,，通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿,，并釋放出巰基fu酶A(COA-SH),，與Ellman 試劑DN-TB 反應后，產(chǎn)生黃色的 TNB,。通過其吸收峰值得變化（412nm）,，來定量分析CPT-1 的活性。

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶試劑盒 脂肪酸系列

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1ml 玻璃比色皿,、研缽、冰,、無水乙醇和蒸餾水

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1ml 試劑一和 10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。將勻漿液于 600g，4℃離心 5min,。

棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心 10min,。

上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CPT-1（此步可選做）,。

在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒,，重復 30 次），用于線粒體 CPT-1 測定,。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測定

（1） 在試劑五中加入 2ml 無水乙醇,，混勻,，再加入 44ml 試劑四，混勻,，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,；

（2） 在試劑六中加入 2ml 蒸餾水,，混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融；

（3） 在 1ml 玻璃比色皿中加入 40μl 樣本,、880μl 試劑五和 40μl 試劑六,，混勻，記錄 412nm 處 20 秒時的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒時的吸光度 A2,，計算ΔA=A2-A1,。

CPT-1 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位,。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，9.6×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.04 ml；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml,；T：反應時間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬。

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶試劑盒 脂肪酸系列