淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase，SP）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase,，SP）是淀粉代謝過程wei一的可逆反應(yīng)酶,，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解,。

在高等植物中,，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)延長淀粉的 α-1,4-葡萄糖鏈的非還原末端,；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,，催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解,，是淀粉代謝過程中的關(guān)鍵酶,。

在植物體中,，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，一般認(rèn)為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解,，因此,，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要測(cè)定意義。

測(cè)定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵與無機(jī)磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸,，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，并在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原 NADP+產(chǎn)生NADPH,，使 340nm 下吸光值增加,。

淀粉磷酸化酶試劑盒  淀粉系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存,；臨用前加入 1.5ml 水溶解,，用不完的試劑分裝后-20℃保存；試劑三：粉劑×1 支,，-20℃保存,；臨用前加入 1.5ml 水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

樣本的前處理：

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,，然后 10000g,，4℃，離心 10min,，取上清待測(cè),。

2、細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒,，間隔 7 秒,，總時(shí)間 3min）；然后 10000g,， 4℃,，離心 10min,，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1,、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm；

2,、工作液的配制：臨用前按照樣本量將試劑一,、試劑二、試劑三按照 170μl:10μl:10μl 的比例混合,，臨用前配制,，半小時(shí)內(nèi)使用。

3,、在 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液,，立即混勻，記錄 340nm 處 1min 時(shí)的吸光值A1 和 6min時(shí)的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

SP 活力單位的計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

SP（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1286×ΔA÷W

（3） 按樣本細(xì)胞計(jì)算

單位定義：每萬個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

SP（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總)÷T

=2.572×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑,， 0.5cm,；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；細(xì)胞數(shù)量,，500 萬,。

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