結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase,，GBSS）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中,，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成,。

測(cè)定原理：

GBSS 催化ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上,，同時(shí)生成 ADP；進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶,、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原為NADPH,，其中NADPH 生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP 數(shù)量呈正比，通過(guò) 340nm 下測(cè)定NADPH 的增加量,，可以計(jì)算GBSS 活性,。

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒   淀粉系列

組成：

BM6004-100T/96S 試劑二臨用前加入 14ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

BM6004-100T/96S 試劑三臨用前加入 8ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

BM6004-100T/96S 試劑四臨用前加入 10ml 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

BM6004-100T/96S 試劑五臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

BM6004-100T/96S 試劑六臨用前加入 0.5ml 蒸餾水,，充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

粗酶液制備：

稱取 0.1~0.2g 組織（建議稱取約 0.1g 組織），加入 1ml 提取液,，冰浴中勻漿,。10000g ，4℃離心 10min,，棄上清,，在沉淀中加入 1ml 提取液充分混勻,，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、在EP 管中按順序加入下列試劑

混勻,，30℃保溫 20 min,，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失）,，冰浴冷卻

混勻,，30℃保溫 30 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊,，防止水分散失）,，冰浴冷卻，10000g 4℃離心 10min,，取上清液（如果一次性測(cè)定樣本較多,，可將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻后立即 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻,。

GBSS 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1,、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

2,、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)=529×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2.6×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,， 1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.075 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min,；稀釋倍數(shù)：

1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1,、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2,、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。

GBSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù) =1059×ΔA÷W V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑,， 0.5cm,；V 樣：加入樣本體積，0.075 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min,；稀釋倍數(shù)：1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量。

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶試劑盒   淀粉系列