腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase,，AGP）活性測定試劑盒

（ 微量法 100T/96S）

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP 反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG,，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測定原理：

AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P,，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH,，340nm 下測定NADPH 增加速率，即可計算AGP 活性,。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒淀粉

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存,；臨用前加入 9mL 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

試劑三：粉劑×1 瓶,，-20℃保存；臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋,、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水

粗酶液制備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。10000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、試劑一置 30℃保溫 10min 以上,。

3、在EP 管中按順序加入下列試劑

混勻,，30℃保溫 15 min,，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失）,，冰浴迅速冷卻后,，4000g4℃離心 5min，取上清液,，在 96 孔板中依次加入下列試劑

混勻后,，立即于 340 nm 波長下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1,。

AGP 活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1,、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

2,、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.01mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下：

1,、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位,。

AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2,、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位,。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

=5627×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑,，0.5cm,；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒淀粉