線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP 合酶,，廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,，由F1和F0 兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化 ATP 合成,，也可逆過(guò)程水解ATP,。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體,、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中,。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP 的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

復(fù)合體Ⅴ水解ATP 產(chǎn)生ADP 和Pi,，通過(guò)測(cè)定Pi 增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性,。

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒   氧化磷酸化系列

試劑的組成和配制：

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存,；臨用前加入 2mL 蒸餾水,，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑六：粉劑×1 瓶,，4℃保存,；臨用前加入 4mL 蒸餾水，充分混勻,；溶解后 4℃保存一周,；試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水,，充分混勻,；溶解后 4℃保存一周；試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存,；臨用前加入 10mL 蒸餾水,，充分混勻；溶解后 4℃保存一周,；定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要,，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿,，以避免磷污染,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣本的前處理：

1、準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞,，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2,、將勻漿 600g,，4℃離心 5min。

3,、棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中，11000g,，4℃離心 10min,。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做）,。

5、步驟 4 中的沉淀即為線粒體,，加入 800uL 試劑二和 8uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W,，超聲 3s,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）,，用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定,。

測(cè)定步驟：

1、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）

混勻,， 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min

混勻,，4000g，25℃離心 10min,，取上清液

混勻,，570nm 下比色，讀取對(duì)照吸光值A1 和測(cè)定管吸光值 A2,，計(jì)算△A=A2-A1,。 2,、定磷(在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫靜置 10min 后,，在 660nm 處讀取A 測(cè)定管和A 對(duì)照管,，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管,。

5,、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 個(gè)NADP⁺或NADPH,。

復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004,；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為A 值,。

1,、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。復(fù)合體Ⅴ活性

（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位,。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1.2×10-4 L,； V 樣：加入樣本體積，0.05 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn),。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 0.637x + 0.004；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）,，y 為A 值,。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位,。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=101.5× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.203× (ΔA-0.004)

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1.2×10-4 L,； V 樣：加入樣本體積,，0.05 mL,；V 樣總：加入提取液體積,， 0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，30 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn),。

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒   氧化磷酸化系列