Ca++ Mg++- ATP 酶活性測定說明書

分光光度法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

Ca⁺+ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物,、動(dòng)物,、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP 水解生成ADP 和無機(jī)磷,。

測定原理：

根據(jù)Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶分解 ATP 生成ADP 及無機(jī)磷,，通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP 酶活性高低。

Ca++Mg++ATP酶檢測試劑盒(微量法)  三羧酸

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；臨用前加入 6ml 蒸餾水充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,。用時(shí)加入 3ml 蒸餾水,， 4℃保存；

試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存,。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水,，溶解后 4℃保存一周；試劑六：粉劑×1 瓶, 4℃保存,。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水,，溶解后 4℃保存一周；

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑八 20 倍稀釋,，即取 0.1ml 試劑八加 1.9ml 蒸餾水充分混勻,；定磷劑的配制：按 H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,，若是藍(lán)色則為磷污染,，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯,、玻棒和玻璃移液器,，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 660nm,，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）

混勻,，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min

混勻,，8000g，25℃離心 10min,，取上清液 3,、定磷（在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置 30min,，在 660nm 處,，記錄各管吸光值。

注意事項(xiàng)

1,、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,，本試劑盒 100 管只能測 48 份Ca^{++ Mg++-ATP 酶。}

2,、此法具有微量,、靈敏、快速的特點(diǎn),。所以對(duì)測定所用試管要求嚴(yán)格無磷,。避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

3,、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

Ca++ Mg++- ATPase 活力的計(jì)算：

1,、血清（漿）Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATPase 活力的計(jì)算:

定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中 Ca⁺⁺ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca^{++ Mg++}-ATP 酶活力（μmol/h/ml）= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATPase 活力的計(jì)算：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中 Ca⁺⁺ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h / mg prot)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷（V 樣×Cpr）÷T =7.5×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每克組織中Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位,。

Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h /10⁴ cell)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.015×（A 測定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度,，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積,，0.25ml,；V 樣：加入樣本體積，0.1ml ,； V 樣總：加入提取液體積,，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間,，1/6 小時(shí),；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重,， g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬,。

Ca++Mg++ATP酶檢測試劑盒(微量法)  三羧酸