順烏頭酸酶（ACO）活性檢測(cè)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

順烏頭酸酶（aconitase）,，三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化,，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng),，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上,，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備,。

測(cè)定原理：

ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸,，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD⁺ 還原生成NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。

順烏頭酸酶活性檢測(cè)試劑盒   三羧酸

組成：

試劑六：粉劑×1 支,，-20℃保存,；臨用前加 3ml 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1 支,，4°保存；臨用前加 36ml 試劑四充分溶解,；

工作液：臨用前在 36ml 試劑七中加入 3ml 蒸餾水,、3ml 試劑四、3ml 試劑五,、3ml 試劑六充分混勻

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1ml 石英比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min,。

3,、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

4,、 上清液即胞漿提取物,，可用于測(cè)定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。

5,、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測(cè)定,。

測(cè)定步驟:

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測(cè)定

（1）將工作液,，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min,；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存,，一星期內(nèi)可用,。

（3）在 1ml 石英比色皿中加入 100μl 樣本 900μl 工作液，混勻,，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A1 和

3min20s 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ACO 活性計(jì)算:

用石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位,。

ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位,。

ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=108×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.722×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.001 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm； V 樣：加入樣本體積,，0.1 ml,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。

順烏頭酸酶活性檢測(cè)試劑盒   三羧酸