羥甲基戊二酰fu酶A 合成酶（HMGCS）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

羥甲基戊二酰fu酶A 合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,，催化乙酰 CoA 與乙酰乙酰CoA 生成羥甲基戊二酰CoA,。

測定原理：

HMGCS 催化乙酰CoA 與乙酰乙酰CoA 生成羥甲基戊二酰CoA，同時產(chǎn)生 CoASH,，使 DTNB 轉(zhuǎn)化為黃色的TNB,，在 412nm 下有特征吸光值。

羥甲基戊二酰fu酶A合成酶試劑盒  三羧酸

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶,，-20℃避光保存,；臨用前加入 7ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融,；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存,；臨用前加入 7ml 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

可見分光光度計,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、1 ml 玻璃比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

樣本測定的準備：

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入1ml 提取液）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

2、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、在 1 ml 玻璃比色皿中加入 125μl 試劑一,、125μl 試劑二和 250μl 試劑三,，混勻，加入 500μl 樣本上清,，迅速混勻后記錄 412nm 下初始吸光值A1 和 4min 后的吸光值A2,。計算ΔA＝A2-A1。

HMGCS 活性計算：

1,、血清（漿）活性

單位定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位,。

HMGCS（nmol/min /ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣 ÷T=36.76×ΔA 2、組織,、細菌或細胞HMGCS 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位,。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=36.76×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位,。

HMGCS（nmol/min /10⁴ cel）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.074×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，1×10^-3 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù),，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.5 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1ml,；T：反應時間，4 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬。

羥甲基戊二酰fu酶A合成酶試劑盒  三羧酸