線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,，線粒體中MDH 是TCA 循環(huán)的關鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反,，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH 在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等,。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH 和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有 NAD-MDH,，在真核細胞中,，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

催化NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸,，導致 340nm 處光吸收下降,。

線粒體蘋果酸脫氫酶試劑盒  三羧酸循環(huán)系列

組成：

試劑五,、粉劑×2 支,，-20℃保存；臨用前加入 300μl 蒸餾水,，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

試劑六,、粉劑×2 支,，-20℃保存；臨用前加入 300μl 蒸餾水,，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。

具體產品的參數(shù)以收到產品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調式移液器,、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本測定的準備：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿液于 600g,，4℃離心 5min,。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的 MDH（此步可選做）,。

在步驟④中的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒，間隔 10 秒,，重復 30 次）,，用于線粒體 MDH 測定。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上,，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零,。

2,、將試劑四在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3,、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中,，混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應 1min

后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2,。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù),。

MDHm 活力單位的計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =1299×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=0.65×ΔA

V 反總：反應體系總體積，8×10^-4 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,； V 樣：加入樣本體積，0.02ml,；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml,；T：反應時間，1 min,；W：樣本質量,， g；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/ml,；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000 萬,。

線粒體蘋果酸脫氫酶試劑盒  三羧酸循環(huán)系列