甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒說明書

分光光度法

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

MCS 廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié),。

甲基檸檬酸合酶試劑盒   三羧酸循環(huán)系列

測定原理：

MCS 催化丙酰CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰fu酶A,，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸,；該反應(yīng)促使無色的DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,，在 412nm 處有特征吸光值。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

組成：

BK6011-10T/9S：試劑五：粉劑×1 支,，4℃保存,，臨用前加入 320μl 無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存,，臨用前加入 320μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

試劑七：粉劑×1 支,，-20℃保存,，臨用前加入 320μl 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）,。

在步驟④中的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體 CS 測定。

BK6011-25T/24S：試劑五：粉劑×1 支,，4℃保存,，臨用前加入 800μl 無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存,，臨用前加入 400μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑七：粉劑×1 支,，-20℃保存，臨用前加入 800μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

BK6011-50T/48S：試劑五：粉劑×2 支，4℃保存,，臨用前加入 800μl 無水乙醇,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑六：粉劑×4 支,，-20℃保存，臨用前加入 400μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑七：粉劑×2 支,，-20℃保存,，臨用前加入 800μl 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿,、研缽,、冰、無水乙醇和蒸餾水

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。將勻漿 600g,，4℃離心 5min。

棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心 10min,。

上清液即胞漿提取物,，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）,。

在步驟④中的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CS 測定,。

測定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、將試劑四,、五,、六和七在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3,、樣本測定

將上述試劑按順序加入 1 ml 玻璃比色皿中,，加試劑七的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在 412nm 波長下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度A1 和反應(yīng) 2min 后的吸光值 A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

MCS 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。 MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位,。

MCS（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

MCS（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.4444×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，9×10^-4 L,；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm； V 樣：加入樣本體積,，0.03 ml,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬。

甲基檸檬酸合酶試劑盒   三羧酸循環(huán)系列