琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase,，SDH）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,。SDH 是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一,。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子,。

測(cè)定原理：

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 處具有特征吸收峰,，通過 600nm 吸光度的變化,，測(cè)定 2．6-DPIP 的還原速度，代表SDH 酶活性,。

琥珀酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、 將勻漿 600g，4℃離心 5min,。

3,、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心 10min。

4,、 上清液即胞漿提取物,，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 SDH（此步可選做）。

5,、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒,，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體 SDH 活性測(cè)定,。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 600nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測(cè)定

（1） 在試劑四中加入 18ml 蒸餾水充分溶解,，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

（2） 在試劑五中加入 1ml 蒸餾水，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本,、10μl 試劑五和 180μl 試劑四,，混勻，立即記錄 600nm處 20s 時(shí)的吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

SDH 活性的計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。 SDH 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.385×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml；

V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬,。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

?

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。 SDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。 SDH 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.77×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm,；d：96 孔板光徑，0.5cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬,。

琥珀酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列