丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase,，PDH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,，催化丙酮酸脫梭生成羥yi基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來,。

測定原理：

PDH 催化丙酮酸脫氫,，同時還原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致 600nm 光吸收的減少,。

丙酮酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列

組成：

工作液的配制：臨用前把試劑五,、試劑六,、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細菌或細胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2、 將勻漿 600g,，4℃離心 5min,。

3、 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心 10min,。

4,、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 PDH（此步可選做）,。

5,、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3 秒，間隔 10 秒,，重復(fù) 30 次）,，用于線粒體 PDH 活性測定。

測定步驟：

1,、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 605nm 處，蒸餾水調(diào)零,。

2,、工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）中孵育 5min,。

3、在 1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 樣本和 900μl 工作液,，混勻,，立即記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2,。

PDH 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。 PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=905×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=182.8×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。 PDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.366×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml；

V 樣總：加入提取液體積,，0.202 ml,；T：反應(yīng)時間，1 min,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬,。

丙酮酸脫氫酶試劑盒 三羧酸循環(huán)系列