內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性測(cè)定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

Cx（EC3.2.1.4）存在于細(xì)菌,、真菌和動(dòng)物體內(nèi),，是纖維素酶系的組份之一，Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物,，隨機(jī)水解糖苷鍵,，將其分解成葡萄糖、纖維二糖,、纖維三糖和其他寡聚體,。

測(cè)定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測(cè)定Cx催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

內(nèi)切-β-1 4-葡聚糖酶活性測(cè)定試劑盒糖代謝

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、水浴鍋,、離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、1ml 玻璃比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、加樣表（在EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴 2h

混勻,， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失）,，冷卻后,，測(cè) 540nm 下吸光值A，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管,。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管,。

Cx 活性計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 6.4078x - 0.0673,；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml）,，y 為吸光值。

2,、血清（漿）Cx 活力的計(jì)算

單位的定義：每ml 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位,。

Cx 活力(μg /min/ml)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷V 樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞,、細(xì)菌和組織中 Cx 活力的計(jì)算

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位,。

Cx 活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

Cx 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位,。

Cx 活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/ml=1000ug/ml,；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.55ml,； V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。

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