葡萄糖脫氫酶（Glucose dehydrogenase，GCDH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高等動物的肝臟和弱氧化醋桿菌中,。在低聚果糖生產(chǎn)中使用GCDH,，不僅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸與鈣離子結(jié)合生成的葡萄糖酸gai是一種理想的補(bǔ)鈣制劑,。因而,，GCDH已成為制備高含量低聚果糖的理想用酶。

測定原理：

GCDH 催化D-葡萄糖和NAD 生成D-葡萄糖酸和NADH,，在 340nm 下測定NADH 上升速率,，即可反映GCDH 活性。

葡萄糖脫氫酶試劑盒   糖代謝系列-常備現(xiàn)貨

組成：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織的前處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零；

2,、工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

3,、將工作液置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘,。

4、在 1ml 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液,，立即混勻,，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1,。

GCDH 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位,。

GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位,。

GCDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V 樣：加入樣本體積,，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬,。

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