α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解,，主要參與棉子糖,、水蘇糖,、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解,。α-GAL 對于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的 D-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗,，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源,，后期則主要參與細(xì)胞壁儲藏多糖水解。

測定原理：

α-GAL 分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基ben酚,，后者在 400nm 有最大吸收峰,，通過測定吸光值升高速率來計算α-GAL 活性。

α-半乳糖苷酶試劑盒  糖代謝系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分溶解備用,；用不完的試劑仍-20℃保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿,、研缽,、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,；15000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。15000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

測定步驟：

1,、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻,，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min

充分混勻,，400nm 處測定吸光值A，計算ΔA=A 測定-A 對照,。每個測定管需設(shè)一個對照管,。

α-GAL 活性計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y =0.00543x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml）,，y 為吸光值,。

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基ben酚定義為一個酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測定,，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基ben酚定義為一個酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/min /g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基ben酚定義為一個酶活力單位,。

α-GAL 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.123×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.5ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05ml,；V 樣總：加入提取液體積， 1ml,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬,；T：反應(yīng)時間,， 30min。

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