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利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）,，任何兩個DNA片段可連接成一個新的重組DNA分子,。通過在PCR引物中引入的額外非同源的核苷酸,，可在連接處產(chǎn)生所需要的讀碼框架或酶切位點,。用該技術(shù)并不需要知道待亞克隆的DNA的核苷酸序列,，只需要知道兩小段伸展于片段兩倆的區(qū)段作為擴增反應(yīng)的引物結(jié)合區(qū),。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑,、試劑盒 | TE 無水乙醇 DNA聚合酶 CTP |
| 儀器,、耗材 | 電泳儀 離心機 PCR儀 |
| 實驗步驟 | 1. 制備模板DNA,，如DNA不是經(jīng)氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶,。 2. 制備寡核苷酸引物,，若PCR產(chǎn)物要進行平端克隆，就應(yīng)該對引物的5’端羥基進行磷酸化處理,。  圖一,、用PCR反應(yīng)引入單一的酶切微點和產(chǎn)生符合讀碼框架的融合蛋白。 3. 建立標準的擴增反應(yīng),，以礦物油覆蓋表面,，在以下條件下進行20~25輪擴增循環(huán)：94℃變性1 min，50℃退火1 min,，72℃延伸3 min,，zui后一個循環(huán)在72℃延伸10 min 盡可能使擴增產(chǎn)物完整。  圖二,、序貫PCR法構(gòu)建重組DNA分子,，引物1b與基因2同源區(qū)域；引物1c有與基因1同源區(qū)域 4. 取少量反應(yīng)混合物（4~8 μl）,，用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效果,。 5. 吸去礦物油上層，用氯仿抽提1次除去殘存的礦物油,，用飽和酚抽提1次,，然后用無水乙醇沉淀DNA。  圖三,、用反向PCR插入酶切位點 6. 4℃高速離心10 min,，沉淀用20 μl TE緩沖液溶解。 7. 用玻璃珠,，電冼脫或低融點膠的酚抽法進一步純化PCR產(chǎn)物可去除未摻入dNTP引物,、無關(guān)的PCR產(chǎn)物和模板DNA,。 8. 對于通過平端連接進行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平擴增片段的3‘末端,。 9. 對于通過粘端連接進行的克?。涸?0 μl 體積用合適的酶消化一半PCR只產(chǎn)物，用過量的酶消化數(shù)小時,。 10. 用合適的末端互補的酶在20 μl 體積內(nèi)消化0.2~2 μg 載體DNA,，用CIP去瞵酸化，以阻止載體自連,。 11. 用普通瓊脂糖或低融點瓊脂溏電泳分離線性化的載體,。 12. 用玻璃珠、電洗脫,、或酚抽法回收線狀的載體,。 13. 連接PCR片段和線狀載體。 14. 取部分連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大楊桿菌,，從轉(zhuǎn)化體集中以小量制備法提取質(zhì)粒DNA,。 15. 用合適的酶消化轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，以瓊脂糖凝膠電泳分析以確證片段的插人,。 16. 測定質(zhì)粒DNA中擴增片段的序列,，檢查有無突變，或者用生物化學(xué)或遺傳學(xué)方面的功能分祈篩選轉(zhuǎn)化體,。 |
