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標簽： T4 DNA 聚合酶
T4 DNA 聚合酶具依賴人為模板的聚合酶活性，同時具有對單鏈,、雙鏈DNA的3’到5’端的外切酶活性,，缺少5’到3’端的外切酶活性,。
實驗方法
- T4 DNA聚合酶
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT |
| 儀器,、耗材 | 水浴鍋 |
| 實驗步驟 | 一、50 μl 反應體積：
二,、dNTp濃度的效應
1. 高濃度的dNTP在通常實驗下可以增加聚合酶活性對外切酶活性的比值。
三、度的效應
用T4 DNA聚合酶標記3’末端時,，反應溫度保持在11℃,，在較髙溫度下，其外切酶活性易降解DNA模板,。 收起 |
| 其他 | 一,、緩沖系統(tǒng)的相容性
許多限制性內切酶能在T4 DNA聚合酶的緩沖系統(tǒng)進行切割反應，同時,，T4 DNA 聚合酶也能直接使用,。 二、應用
1. 放射性標記DNA段的3’末端,，含5’凸出端的DNA段及濃度為1~2 μmol/l 的適當［α-32P］dNTP,，在11℃溫育20 min。
2. 選擇性及無選擇標記線性化雙鏈DNA分子的3’宋端,，即所謂的“置換合成”,。雙鏈 DNA段在dNTP存在下與T4 聚合酶溫育，其3’末瑞的外切酶活性導致從 3’末端降解DNA,，當補加4種dNTP后,，可激活其聚合酶活性，延伸DNA鏌板的3’末端,。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板時加入4種dNTP混合液,，可獲得zui隹標記效果。 |
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