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標(biāo)簽： T4 DNA 聚合酶
T4 DNA 聚合酶具依賴(lài)人為模板的聚合酶活性,，同時(shí)具有對(duì)單鏈、雙鏈DNA的3’到5’端的外切酶活性,，缺少5’到3’端的外切酶活性,。
實(shí)驗(yàn)方法
- T4 DNA聚合酶
| 實(shí)驗(yàn)材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT |
| 儀器,、耗材 | 水浴鍋 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一,、50 μl 反應(yīng)體積：
二,、dNTp濃度的效應(yīng)
1. 高濃度的dNTP在通常實(shí)驗(yàn)下可以增加聚合酶活性對(duì)外切酶活性的比值。
三、度的效應(yīng)
用T4 DNA聚合酶標(biāo)記3’末端時(shí),，反應(yīng)溫度保持在11℃,，在較髙溫度下，其外切酶活性易降解DNA模板,。 收起 |
| 其他 | 一,、緩沖系統(tǒng)的相容性
許多限制性?xún)?nèi)切酶能在T4 DNA聚合酶的緩沖系統(tǒng)進(jìn)行切割反應(yīng)，同時(shí),，T4 DNA 聚合酶也能直接使用,。 二、應(yīng)用
1. 放射性標(biāo)記DNA段的3’末端,，含5’凸出端的DNA段及濃度為1~2 μmol/l 的適當(dāng)［α-32P］dNTP,，在11℃溫育20 min。
2. 選擇性及無(wú)選擇標(biāo)記線(xiàn)性化雙鏈DNA分子的3’宋端,，即所謂的“置換合成”,。雙鏈 DNA段在dNTP存在下與T4 聚合酶溫育，其3’末瑞的外切酶活性導(dǎo)致從 3’末端降解DNA,，當(dāng)補(bǔ)加4種dNTP后,，可激活其聚合酶活性，延伸DNA鏌板的3’末端,。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板時(shí)加入4種dNTP混合液,，可獲得zui隹標(biāo)記效果。 |
