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DNA實驗技術(shù):生物素?;结樀闹苽鋵嶒?/h3>

2013-9-4  閱讀(2297)

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標(biāo)簽: 生物素 酰化 探針

在標(biāo)準的切口平移實驗體系中,,生物素-11-dNTP取代了dNTP,,DNA酶I 的濃度調(diào)整到可生成長100~500個核苷酸的范圍,其他生物素?;暮塑账嵋部纱嫔锼?11-dNTP,。

實驗方法

  • 切口平移法
  • 隨即寡核苷酸引物合成法

實驗材料

DNA

試劑、試劑盒

DNA聚合酶 dNTP 2-疏基乙醇 生物素  NaCl EDTA SDS 無水乙醇

儀器,、耗材

注射器 電泳儀 離心機 培養(yǎng)箱

實驗步驟

1.  混合以下物質(zhì)于100 μl 反應(yīng)體積:


(1)10 μl  10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ緩沖液

(2)10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

(3)10 μl  0.5 mmol/l 生物素-11-dNTP貯存液

(4)10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

(5)2 μg  DNA

(6)20 U  大腸桿菌聚合酶Ⅰ

(7)DNA酶Ⅰ貯存液,,用錢用冷水稀釋1000倍

(8)加水到100 μl,15℃溫育2~2.5 h,。


2.  取6 μl 反應(yīng)液,,煮沸3 min 置于冰浴2 min。

 

3.  加樣于瓊脂糖凝膠,,同時帶對照分子量標(biāo)準,,在15 V/cm 電壓降下電泳。

 

4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之間,,接步驟5繼續(xù),,若大小在500~1 000核苷酸之間(或更大)加入第二份DNA酶Ⅰ繼續(xù)溫育。

 

5.  加入2 μl,,0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS,,68℃加熱10 min 終止反應(yīng)和滅活DNA酶Ⅰ。

 

6.  在1 ml 注射器中準備如Sephadex G-50離心柱,,用2 ml 無水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接著用4ml H2O沖洗,,將G-50介質(zhì)裝入注射器至刻度,,用100 μl SDS柱緩沖液冼3~4次,上樣,。

8.  分離生物素?;奶结槨L结槤舛葢?yīng)約為20 ng/μl ,,探針可直接使用,,也可在-20℃保存數(shù)年而不喪失活性,。

 

9.  用比色法估計生物素酰化反應(yīng)的程度和探針的質(zhì)量或進行化學(xué)發(fā)光檢測,。

 

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