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一,、堿變性法提取質(zhì)粒DNA
質(zhì)粒（Plasmid）是細(xì)菌染色體外能自身獨(dú)立復(fù)制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細(xì)菌某些新的表型,。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查已成為現(xiàn)實(shí),。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用,。
分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，但這些方法基本包括三個(gè)步驟：即細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增,，細(xì)菌菌體的裂解,；質(zhì)粒DNA的提取與純化。
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA,。
原理
細(xì)菌培養(yǎng)物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后,，菌體裂解，可使細(xì)菌的質(zhì)粒DNA,、染色體DNA和RNA一起從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶,。用溴化乙錠（EB）染色后,，在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據(jù)熒光的位置,，可區(qū)分不同的核酸帶,。
材料
1．菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）
2．試劑溶液Ⅰ（50mM葡萄糖,，25mMTris.HclPH8.0,，10mMEDTA）
溶液II（0.2NNaOH，1%SDS）用前新配制
溶液III（5mMKAc溶液PH4.8）
TE緩沖液（10mMTris.HCl,，1mMEDTAPH8.0）
LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g,，酵母粉5g，Nacl10g,。加蒸餾水溶解,，用NaOH調(diào)PH至7.5，加水至1000ml,，15磅高壓滅菌15分鐘）,。
方法
1．接種細(xì)菌于5mlLB液體培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng)過。
2．3000rpm/min,，離心15min,，棄上清。加入100ul溶液Ⅰ懸起細(xì)菌沉淀,。
3．加入200ul前新配制的溶液II,，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min,。
4．加入150ul溶液III溫和地混勻,，12000rpm/min,離心5min。
5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次,，12000rpm/min，離心2min,。（若不做酶切,，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍體積的冷乙醇,，12000rpm/min,，離心10min。
6．棄乙醇,，干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸,，待電泳檢測。
二,、瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（Agarosegelelectroghoresis）是分離,、鑒定和提純DNA斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度,，并由此決定凝膠的孔徑,。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場作用,。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng),，此外，在弱堿性條件下,，DNA分子帶負(fù)電荷,，從負(fù)極向正極移動(dòng)。根據(jù)DNA分子大小,、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過介質(zhì)運(yùn)動(dòng)而相互分離,。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結(jié)合的作用,，利用EB染色,，并通過紫外線激發(fā)即可觀察被分離DN段的位置。
材料
1．瓊脂糖,、10×TAE電泳緩沖液（40mMTris,，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）
2．載體緩沖液（0.25%溴酚藍(lán),，30%）,、溴化乙錠水溶液（10mg/ml）
3．凝膠槽、電泳儀
方法
1．取瓊脂糖0.9g,，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中,，100℃加熱溶解。
2．平衡凝膠槽,，放好兩側(cè)擋板,，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.5~1mm）。
3．鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液,，輕輕混勻,，待冷至50℃左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5~8mm,。
5．DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）,。
6．打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓,，電壓與凝膠的長度有關(guān),，一般使用電壓不超過5v/cm。
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4．待膠*凝固后,，去掉兩側(cè)擋板,，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負(fù)，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)）,，使液面高出凝膠2~3mm,，小心拔出梳子。
．據(jù)指示染料移動(dòng)的位置,，確定電泳是否終止（溴酚藍(lán)的涌動(dòng)距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間）,。
8．電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照,。
